乳腺癌患者（4.60 bp，172.33至167.73 bp）定位到低甲基化区域的cfDNA片段的平均大小（100–220 bp）比健康个体（2.87 bp， 174.54 至 171.67 bp）减少得更多。此外，在两个独立的队列中，与高甲基化区域相比，低甲基化区域的短cfDNA片段 （100-150 bp）的比例在乳腺癌患者中增加得更多。在验证队列中，评估了使用低甲基化基因组区域短cfDNA片段比值异常进行乳腺癌诊断的可行性。11名患者中有7名被确认为患有乳腺癌（敏感性为 63.6%），没有健康个体被错误检测（100% 特异性）。

结果 1

cfDNA片段谱乳腺癌患者变化小

      在本研究中，利用改进的cfMeDIP-seq方法和新设计的含有分子条形码的多重接头来去除PCR重复。据报道，与非癌症来源的cfDNA片段相比，癌症来源的cfDNA片段表现出改变的甲基化和更小的尺寸，本文将分析重点放在100至220个碱基对（bp）的cfDNA片段上，这使其能够研究癌症来源的cfDNA的释放是否与DNA甲基化有关。在对发现队列 1 的初步分析中，从 3名健康个体（H1、H2 和 H3）和 3 名乳腺癌患者（P1、P2 和 P3）的血浆中提取的 cfDNA 用于 cfMeDIP-seq 文库的构建，这些患者处于手术后恢复期，肿瘤负荷相对较低。有趣的是，与健康个体的文库相比，IP 文库中的短 cfDNA 片段 （100–150 bp） 密度和比率（定义为短 cfDNA 片段与长 cfDNA 片段的比率 （151–220 bp））显着降低（图下A-C 和 G），而这些现象在乳腺癌患者中未见。此外，在健康个体中，发现平均cfDNA片段大小从170.06（输入文库）增加到173.04（IP文库）bp，这在乳腺癌患者中也没有观察到（170.51至170.71 bp）。为了检查健康个体和乳腺癌患者之间的差异，计算了从 IP 文库到相应输入文库的短片段比率的变化，本文发现与健康个体相比，乳腺癌患者的变化较小。

结果 2

cfDNA中甲基化与片段大小的关系

      为了检查富集的短 cfDNA 片段与乳腺癌患者DNA甲基化之间的关系，本文首先在乳腺癌患者和健康个体之间的 cfDNA 中鉴定了 2211 个差异甲基化区域（DMR）（下图A、B4）。然后，评估了 IP 文库中 DMRs 依赖性 cfDNA 片段化模式，发现从低甲基化区域释放的 cfDNA 在患者和健康个体中都比高甲基化区域具有更高的短片段比率（下图 C）。进一步分析表明，乳腺癌患者在低甲基化区域的短片段比大于高甲基化区域（下图D），这表明富集的短cfDNA片段可能主要从低甲基化区域释放。

根据低甲基化区域短片段比率的增加情况，与定位到高甲基化区域的cfDNA片段相比，本文发现映射到低甲基化区域的cfDNA片段的大小分布向较小尺寸的方向移动，并且这种变化在乳腺癌患者中程度更大（下图 A-F）。此外，乳腺癌患者定位到低甲基化区域的 cfDNA 片段平均大小下降幅度大于健康个体。

结果 3

乳腺癌的 DMR 依赖性 cfDNA 片段谱

      为了研究甲基化数据在乳腺癌诊断中的作用，本文尝试了应用DMR依赖性cfDNA片段谱来区分发现队列1中的癌症患者和健康个体的可行性。通过分析多个基因组窗口大小（300 bp、500 bp、1 kb、2 kb、5 kb 和 10 kb）的 cfDNA片段化，以确定同时出现甲基化和片段化的最佳范围。本文发现 10 kb 窗口提供了足够的分辨率来描绘 DMR，同时保留足够的 cfDNA 片段来可靠地定量短片段比率。为了解决 5mC-IP 之前的短片段带来的潜在偏差，在每个 10 kb DMR 窗口的相应输入库中对 IP 文库中的短片段比率进行归一化。针对 93 个高甲基化基因组窗口和 691个低甲基化基因组窗口计算了该输入调整的短片段比率，定义为所有样品中至少有 20个非重复的 cfDNA 片段，并且输入调整后的短片段比率低于 10。正如预期的那样，低甲基化基因组窗口中的输入调整短片段比率可以区分癌症患者和健康个体，这在高甲基化基因组窗口中很少观察到（下图A）。此外，具有诊断性碎片谱的低甲基化窗口分布在几乎所有染色体上（下图B）。这些发现表明，DMRs依赖性cfDNA片段谱的变异可以区分乳腺癌患者和健康个体。

结果 4

验证队列中的乳腺癌诊断的准确性

      为了验证从发现队列中获得的结果是否可以应用于乳腺癌的诊断，本文对验证队列中 11 名乳腺癌患者和8名健康个体中提取的cfDNA进行了cfMeDIP-seq。该队列中的所有乳腺癌患者均未接受过既往治疗，并通过活检确诊。同样，观察到乳腺癌患者IP文库中的短cfDNA片段密度增加。

      随后，本文评估了DMR依赖性cfDNA片段谱是否可以在验证队列中区分癌症患者和健康个体。结果发现，大多数乳腺癌患者在特定的低甲基化基因组窗口中存在异常的输入调整短片段比率，而在健康个体中则保持一致。

      最后，本文开发了一种称为“DMRs依赖性cfDNA片段谱的相关性评估”的方法，以评估72个经常改变的低甲基化基因组窗口中短片段比率的异常，其中所有样品至少有20个未重复的cfDNA片段，每个窗口内任何样本的输入调整短片段比率不超过10。对每个参与者的 72 个低甲基化窗口中的输入调整短片段比率与健康个体的中位数进行了相关性分析。结果发现，健康个体的平均相关性较高，为0.83，而乳腺癌患者的相关性较低，平均为0.68（下图A）。用于检测癌症患者的受试者特征分析的曲线下面积 （AUC） 值为 0.909（95% 置信区间，0.771–1.000）（下图B）。综上所述，DMRs依赖性cfDNA片段分析可以区分乳腺癌患者和健康个体。

参考文献

Wang J, Niu Y, Yang M, Shu L, Wang H, Wu X, He Y, Chen P, Zhong G, Tang Z, Zhang S, Guo Q, Wang Y, Yu L, Gou D. Altered cfDNA fragmentation profile in hypomethylated regions as diagnostic markers in breast cancer. Epigenetics Chromatin. 2023 Sep 23;16(1):33. doi: 10.1186/s13072-023-00508-4. PMID: 37740218; PMCID: PMC10517480.