01合成生物学发展：蓝藻生物燃料生产的挑战与前景

　　合成生物学研究发展迅速，随着基因编辑技术、DNA合成技术的兴起，该学科在多领域展现出广泛前景，如新药开发、生物基化学品、农作物改良等，这些创新性发展具有高经济价值，是政策、资本、工业等关注的热点。

　　以蓝藻为例，蓝藻可以合成生物燃料，比如乙醇、丁醇、生物柴油和氢气等，可提供丰富经济的能源，比如说基因改造后的蓝藻能以12.6克/升的产能生产丁二醇，非常具有前景。

　　但合成生物学目前面临几个痛点，比如复杂产物合成与调控困难等，生物体代谢网络和信号通路复杂，精确设计和改造并不容易。以蓝藻代谢工程为例，掌握复杂代谢网络的动态变化非常重要，如果开展基因编辑的话，科技人员需要清楚了解基因改良后的蓝藻代谢变化，以真正实现工业化生产。

　　代谢组和代谢流可以有效测量蓝藻代谢通路中的代谢物变化，提供代谢活动的全景图，深入理解代谢调控机制，有助于推动蓝藻在生物燃料和化学品生产中的应用，使其更接近工业化生产实际。

 

　　图1.展示了蓝藻代谢组学和代谢流（此文称为Fluxomics）分析的流程图

　　处于指数生长期的蓝藻（注入13C同位素标记的示踪剂用于代谢流），在不同时间点取样后，立即放入预冷的淬灭液，离心收集细胞后快速液氮冷冻，-80°C保存到代谢物提取。代谢物提取后干燥，如进行GC-MS分析，则进行衍生化处理；如进行LC-MS分析，可不经过衍生化处理而直接重悬在溶剂中上机。

　　02蓝藻代谢网络检测策略

　　合成生物学改造蓝藻的主要目标就是通过基因工程加快代谢中的碳固定，并生成可供人类利用的燃料，为实现对这个环节的把握，利用代谢组学和代谢流技术来监测蓝藻的代谢状态十分重要。

　　代谢组学可以实现对蓝藻中所有小分子或代谢中间体的全面分析，而代谢流可以推算代谢反应的速率，从某种角度来理解，两种技术的利用，能得到评估产物类型和产量的重要参数。

　　当前的代谢组学分为非靶向和靶向两种，前者以检测样本中所有可能的代谢物为目的，可以较全面的分析多个代谢通路；后者以精确测量某特定代谢物浓度为目的，可以实现不同研究之间的比较。

　　这两种方法虽然可以得到代谢物水平的静态信息，却无法完全理解细胞代谢的全程，因为代谢本身是一个涉及细胞内代谢物连续运输和转换的动态生化过程，物质从输入到输出形成了一个复杂的代谢网络，所以如果需要测量评估整个代谢网络的功能和调控，就需要进一步结合代谢流技术，以提供细胞内复杂代谢运行的信息（图1）。

　　03蓝藻代谢物检测前处理与技术平台

　　鉴于蓝藻的代谢快速可变，可在几秒内响应外部环境的变化，因此淬灭代谢相对重要，可以用冷甲醇（-20°C或更低）、液氮等进行失活处理，淬灭后继而离心，可快速连续收集多个样本。在淬灭和收获样本后，可以根据代谢物类别的不同来优化提取方法，比如说对于蓝藻代谢中间体来说，氯仿/甲醇/水混合物提取法可供参考。

　　基本上来说，代谢组与代谢流都包括三个步骤：（1）淬灭、代谢物提取和样本准备；（2）测量代谢物丰度；（3）分析代谢组数据。除了样本前处理（包含淬灭、收集获、提取），后续的鉴定环节（可包含衍生化、上机、数据分析等）也同样重要，根据分离技术与鉴定平台的不同，相关的分析（MS和NMR）技术优缺点可见表1。

 

　　04 FBA和13C-MFA

　　以筛选工业化生产蓝藻种类为目的来说，了解代谢物在不同环境条件下的动态变化是基本需求，对于不同代谢物定量变化，使用FBA（通量平衡分析）和13C-MFA（碳13代谢通量分析）来准确计算代谢流至关重要。

　　FBA是一种基于代谢网络的计算方法，用于预测细胞内部代谢通量分布，其核心是通过数学优化方法来求解代谢网络中各反应的通量，以满足特定的生物学目标，如最大化生物量生产或其他特定代谢产物的合成，广泛应用于代谢工程，用于预测代谢网络的行为、指导遗传改造以及理解代谢调控机制。但其缺陷在于无法提供代谢通量的动态信息。

　　13C-MFA是一种利用稳定同位素标记技术来定量分析细胞内代谢通量的方法，通过向培养基中添加含有稳定同位素（如13C）标记的底物，然后追踪这些标记原子在细胞代谢网络中的分布和转化，来确定代谢通量，可提供代谢通量的动态信息，包括代谢物的合成和消耗速率，相比FBA，它可以提供更精确的代谢通量测量，但其数据分析需要复杂的计算模型，成本也较高。

　　因此，FBA和13C-MFA是互补的两种方法，FBA侧重于基于现有代谢网络模型的通量预测，而13C-MFA侧重于通过实验数据直接测量代谢通量，两者结合使用可以更全面地理解和操控细胞的代谢活动。

 

　　图2.展示蓝藻中13C-MFA的工作流程

　　包含SS-MFA（稳态代谢通量分析）和INST-MFA（非稳态同位素标记代谢通量分析）两种方式，SS-MFA要求达到同位素标记的动态平衡，即稳态条件，INST-MFA不依赖于同位素标记的稳态，而是利用动态变化信息来分析。

　　前者为异养培养，用13C标记的葡萄糖或甘油进行标记；后者为自养培养，用13CO2或碳酸氢盐标记。收集样本检测后，分析同位素标记随时间变化，计算底物摄取、产物形成的速率。异养培养用SS-MFA分析，自养培养用INST-MFA分析。最后通过不断调整以最小化模型间差异，获得最优通量模型。

　　05稳态13C-MFA（稳态代谢通量分析）和INST-MFA（非稳态同位素代谢通量分析）

　　蓝藻代谢通量测量主要依赖于两种方法（图2）：稳态13C-MFA（稳态代谢通量分析）和INST-MFA（非稳态同位素代谢通量分析）。

　　稳态13C-MFA要求达到同位素稳态，即13C完全并入代谢物，通常在连续培养中进行，通过测量稳态下碳同位素异构体的分布，推断代谢分支点的通量比或绝对通量，适用于异养或混合营养条件下的蓝藻，识别特定生化产物生产的代谢途径依赖性。

　　INST-MFA不需要达到同位素稳态，适用于自养系统和标记缓慢的实验，利用微分方程描述同位素分布随时间的变化，通过实验数据拟合来模拟动态同位素标记剖面。相比SS-MFA，INST-MFA在实验和计算上要求更高，需要在多个时间点测量同位素异构体分布。

　　总的来说，这两种方法提供了在不同条件下测量细胞内代谢通量的强大工具，有助于深入理解代谢网络的动态行为和优化代谢工程策略（表2）。

　　代谢组学和代谢流分析（包括SS-MFA和INST-MFA）在蓝藻代谢工程中具有明显应用价值，可以揭示代谢能力，识别快速生长蓝藻菌株的代谢适应性，增加对不同生长条件下代谢通量重排的全面理解，识别代谢通量重定向机制，为蓝藻合成生物学提供代谢调控和改良结果的必要信息。

　　当然，目前有关蓝藻代谢物数据库和代谢流技术仍有待完善，全面获取和分析解释大型代谢物数据集仍具有挑战性，需要考虑联合使用多种技术，提高结果的全面性和准确性，通过进一步加强软件工具和分析能力，可进一步扩展代谢组学和代谢流技术在合成生物学中的应用。

　　参考文献 Babele PK,Young JD.Applications of stable isotope-based metabolomics and fluxomics toward synthetic biology of cyanobacteria.Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med.2020 May;12(3):e1472.doi:10.1002/wsbm.1472.Epub 2019 Dec 9.PMID:31816180.