一、背景介绍

         大脑运行需要旺盛的代谢，比如神经元被激活时，去极化会迅速引发ATP、AMP等物质的变化，以支持神经递质释放、动作电位传导等生理活动。已知神经元受刺激后会增加糖酵解和调节磷酸戊糖途径（PPP），糖酵解成份会在30秒内显著上升，而肌苷则会进入PPP以短时间满足能量需求。鉴于神经元与代谢的紧密关系，研究脑细胞代谢至关重要，质谱成像技术可以检测组织切片中代谢物空间分布，进一步结合稳定同位素标记则可以实现动态监测，本研究结合两种技术研究新鲜脑切片，增进了对神经元生理或病理状态下代谢变化的理解。

 

二、材料方法

 

 

         样本来源为野生型C57BL/6N小鼠，麻醉后取出大脑置于冰冻切片液中，以切片机将大脑海马区处理成450微米组织切片孵育备用。对切片的操作包括C13-葡萄糖或C13-肌苷进行同位素标记，电刺激齿状颗粒细胞（DGC）层模拟电生理活动，氯化钾诱导神经元去极化模拟兴奋状态，添加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶抑制剂（G6PDi）和嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂来抑制代谢等。

 

         空间代谢样本前处理包括快速加热脑切片后迅速冷却以固定代谢物状态，固定后冷冻切片至10微米厚度，基质喷雾处理后进行质谱成像分析，质谱设备为Bruker timsTOF fleX，以负离子模式成像分析，空间分辨率为20微米，质谱数据分析包括以SCiLS Lab、mMass等软件确定代谢物的种类和相对含量。对于钙成像与荧光成像，分别进行幼鼠注射AAV2/9.CAG.GCaMP6f实验和相应切片免疫组化实验。

 

三、结果讨论

         研究主要探究了大脑海马体齿状颗粒细胞（DGC）层，它们是齿状回的主要神经元群体，质谱成像研究发现，高浓度氯化钾刺激后1分钟内ATP和磷酸肌酸显著下降而AMP上升，刺激后30秒内糖酵解中间体增加，PPP中肌苷代谢为核糖-1-磷酸增加。研究突显了肌苷代谢在神经响应中的重要性，这些肌苷主要在DGCs内生成，使用抑制剂则可以阻断肌苷生成。通过诱导癫痫刺激，进一步发现了神经元能量代谢响应的保守一面，癫痫诱导与氯化钾效果趋同，均发现DGCs表现类似能量代谢变化，比如PPP和糖酵解中间体的增加。

         另外在刺激结束后，恢复期间DGCs的能量代谢仍然活跃，比如PPP代谢物质仍保持高位，表明仍需通过加速代谢来恢复能量储备。研究揭示了神经元在急性刺激下的动态代谢变化，强调了肌苷代谢在神经元能量代谢中的关键作用，为理解神经元如何调节其活动和应对能量需求提供了新的视角，也为研究神经系统疾病中的代谢失调提供了重要的参考。

 

四、研究结论

         本研究开发了一种脑切片快速固定代谢物的方法，通过结合质谱成像和同位素标记技术，提供了一种研究神经元代谢的新策略，是在细胞水平上监测代谢物动态变化的有效工具。研究阐述了神经元在刺激下的快速代谢变化，比如糖酵解、PPP、肌苷代谢等，表明神经细胞代谢的灵活性，能迅速响应能量需求。研究发现肌苷代谢的关键作用，特别是通过嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）将肌苷代谢为核糖-1-磷酸（R1P）进入PPP途径，这一发现具有潜在的临床应用前景，比如说PNP活性的调节可能成为未来治疗神经系统疾病的新策略。

 

五、结果展开

图1. 显示脑切片实验、切片热固定、质谱成像及数据分析流程。

 

a. 显示海马体切片放置在灌流槽中，可开展氯化钾刺激、稳定同位素标记或药物处理实验，灌流设备底部装有控温装置，以在特定时间点进行代谢固定。
b. 显示切片热固定步骤，首先将切片置于80°C持续2秒之后迅速冷却至4°C，快速冷冻后存储于-80°C，这种方法可以更好保持ATP:AMP比率
c. 显示质谱成像样本准备，样品冷冻切片后铺在专用波片上喷涂基质以备MALDI-MS。
d. 显示齿状回（DG，红色）区域，基于m/z=241的代谢成分勾勒出。
e. 显示齿状回区域代谢物质谱图。
f. 显示质谱图注释情况，实验谱图与参照数据库比对识别代谢物水平变化。
g. 显示电刺激实验示意图，将电极在齿状回区域进行30秒电刺激（1秒脉冲）模拟神经元急性激活。
h. 显示电刺激后不同代谢物的分布，比如ATP、AMP、磷酸肌酸（Pcreatine = phosphocreatine）及戊糖磷酸盐（PentoseP = pentose phosphates）等。

 

图2. 显示齿状颗粒细胞层的动态代谢变化。

 

a. 海马体切片经50 mM KCl处理后30秒、1分钟、2分钟、3分钟和5分钟检测代谢物水平。结果显示神经元迅速调整代谢，比如短时间内甘油醛-3-磷酸（GAP）、磷酸甘油酸（PG）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）等糖酵解中间产物增加，表明糖酵解增强；之后戊糖磷酸盐（PentoseP）和6-磷酸葡糖酸（6PG）等上升，提示戊糖磷酸途径被激活。

b. 代谢物相关性分析显示，能量底物（如ATP、ADP、AMP）之间相关表明它们的协同变化；这种相关性也存在于糖酵解中间体（如甘油醛-3-磷酸、磷酸甘油酸）之间，以及磷酸戊糖途径中的代谢物（如戊糖磷酸）与嘌呤代谢中间体（如次黄嘌呤、黄嘌呤）之间。

 

图3.  描述了同位素标记实验证实神经元在刺激下葡萄糖代谢加速并且肌苷代谢参与供能。

 

a. 质谱成像显示PC(38:4)（m/z 810.6）和SM(d34:1)（m/z 703.58）在肾小球内分布的异质性。
b. 多重免疫染色显示podocalyxin、CD31和tensin在肾小球内分布。
c. 通过对MxIF数据进行k-means聚类分析并将不同簇与特定细胞类型进行关联。

 

图4. 显示肌苷为细胞内源生成，外部添加肌苷可为非氧化戊糖磷酸途径（non-oxPPP）和糖酵解途径提供碳原子供应。

 

a. 显示添加核苷转运蛋白SLC29A1/A2抑制剂后肌苷和戊糖磷酸盐（PentoseP）的差别，表明抑制剂显著影响肌苷和戊糖磷酸盐的水平。
b. 显示不同前体转化为肌苷的途径，展示了腺苷脱氨酶（ADA）、AMP脱氨酶（AMPD）和外切5'-核苷酸酶（Ecto）的作用靶点，这些酶在肌苷的生成过程中起关键作用。
c. 显示抑制剂处理切片实验中，包括经cpd3（AMPD抑制剂）和pentostatin（ADA抑制剂），或MethADP（Ecto抑制剂）处理，KCl刺激能增加肌苷和PentoseP水平，表明肌苷主要在细胞内生成，且途径具有一定的灵活性。
d. 显示C13-肌苷分子式以及相关实验设计流程，以对比静息和激活状态下神经元肌苷代谢的动态变化。
e. 对比静息和KCl刺激的切片中，PentoseP同位素标记的相对变化。结果显示，KCl刺激显著增加了C13-肌苷的标记率，表明外源性肌苷可以进入PPP并被代谢。
f. 对比静息和KCl刺激的切片中，C13-肌苷标记的代谢物相对变化。结果显示，KCl刺激显著增加了糖酵解中间体和PPP代谢物的C13标记率，表明外源性肌苷可以为PPP和糖酵解提供碳原子。

 

图5. 显示肌苷为细胞内源生成，外部添加肌苷可为非氧化戊糖磷酸途径（non-oxPPP）和糖酵解途径提供碳原子供应。

 

a. 显示癫痫诱导实验示意图，应用picrotoxin（Picro，GABA受体拮抗剂）孵育海马切片，模拟癫痫发作时的神经元异常活动。
b. 显示应用picrotoxin刺激后磷酸肌酸（PCr）与肌酸（Cr）比值变化，PCr/Cr比值显著下降表明细胞能量储备被消耗，细胞处于能量应激状态。
c. 显示显示糖酵解中间体（如甘油醛-3-磷酸/二羟基丙酮磷酸（GAP/DHAP）、磷酸甘油酸（PG）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP））的变化。结果表明这些代谢物在picrotoxin刺激后显著增加，表明糖酵解活动增强，细胞试图通过加速糖酵解来补充能量。
d. 显示在picrotoxin刺激后，6-磷酸葡萄糖酸（6PG）和戊糖磷酸（PentoseP）水平的变化，表明磷酸戊糖途径（PPP）也被激活，细胞通过PPP生成更多的NADPH和核糖-5-磷酸，以支持生物合成和抗氧化需求。
e. 显示picrotoxin刺激后，IMP和肌苷水平显著升高，表明嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）活性增强，肌苷代谢被激活，细胞通过PNP将肌苷转化为核糖-1-磷酸（R1P），为PPP提供额外的碳源。
f. 质谱数据分析表明R1P对戊糖磷酸库的贡献增加，R1P在PentoseP中的比例显著升高，进一步证实PNP活性在癫痫样事件中对PPP的贡献。
g. 显示活细胞成像与空间代谢实验设计示意图，通过活体注射GCaMP，切片后经KCl刺激，可以实现同时监测神经元活动和代谢变化的目的。
h. 对比戊糖磷酸（PentoseP）水平变化，显示G6PD抑制剂（G6PDi）和PNP抑制剂（Forodesine）对PentoseP水平有显著影响，表明PNP活性在维持细胞能量平衡中发挥重要作用。
i. 对比磷酸肌酸（PCreatine）水平变化，显示抑制PNP（Forodesine）会导致PCreatine水平显著下降，而抑制G6PD（G6PDi）则没有显著影响，突显PNP在恢复期间对细胞能量平衡的重要性。

 

参考文献：

Miller A, York EM, Stopka SA, Martínez-François JR, Hossain MA, Baquer G, Regan MS, Agar NYR, Yellen G. Spatially resolved metabolomics and isotope tracing reveal dynamic metabolic responses of dentate granule neurons with acute stimulation. Nat Metab. 2023 Oct;5(10):1820-1835. doi: 10.1038/s42255-023-00890-z.