一、背景介绍

          系统性硬化症（SSc）是复杂的自身免疫性疾病，会呈现广泛的微血管病变及免疫系统异常激活等症状，微血管病变现象在SSc中最早出现，比如微血管对寒冷或情绪刺激过度反应，出现血管壁增厚、管腔狭窄，导致组织缺氧等，其病理过程涉及内皮细胞损伤、免疫细胞浸润、成纤维细胞活化等，但具体机制仍需进一步阐明。空间蛋白质组学研究可以识别细胞亚群，并保留其空间位置信息，从而揭示详细表征患者血管细胞组成变化和相互作用。

 

二、材料方法

 

          研究队列包含了19名SSc患者和14名对照者，提取皮肤活检样本后开展空间蛋白质组学研究。蛋白抗体的选择包含了用于识别血管内皮细胞（VECs）、淋巴管内皮细胞（LECs）和免疫细胞亚群（如CD3、CD20、CD68）的标记物，抗体经测试后用于蛋白成像检测，应用38种金属标记抗体进行染色，对染色切片进行分析，分割单个细胞并提取空间位置，基于特定标记物，分选为主要细胞类型（上皮细胞、ECs、免疫细胞、基质细胞、周细胞和血管平滑肌细胞），使用无监督聚类分析将ECs分为不同亚群，统计分析比较患者和对照细胞亚群的差异，进行细胞微环境分析。利用CODEX共定位技术验证空间蛋白质组学的发现，分析关键标记物和细胞类型；并利用酪胺信号放大（TSA）技术，以过氧化物酶系统增强检测灵敏度，进一步验证特定细胞群体的存在和分布。

 

三、结果讨论

          研究结果显示，SSc患者皮肤中的血管内皮细胞（VECs）和淋巴管内皮细胞（LECs）密度显著降低，覆盖面积和细胞数量均显著减少，表明SSc患者存在广泛的微血管丢失。研究识别出了7种VECs亚群、2种LECs亚群和3种周细胞亚群，在SSc样本中，一种新型的CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 细胞亚群数量显著增加，这种新型VECs亚群表达内皮-间充质转化的标记物，如SNAI12等，其微环境富含免疫细胞，比如T细胞，其中肌成纤维细胞亚群密度与皮肤纤维化进展相关，尤其是在疾病早期和皮肤纤维化进展的患者中。这些发现为开发针对SSc纤维化的治疗策略提供了新的靶点，例如通过干预内皮-间充质转化过程或调节免疫细胞与内皮细胞的相互作用。

 

四、研究结论

          本研究通过空间蛋白质组学技术，对系统性硬化症患者的皮肤活检样本进行了高分辨率的单细胞分析，揭示了SSc中血管细胞的异质性和血管生态位的特征，其中一种新型的CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞亚群，与纤维化进展相关，可能作为标志物，为诊疗提供新方向。空间蛋白质组学在单细胞水平上解析细胞的表型及其空间分布，弥补了传统单细胞测序技术无法提供空间信息的不足，为研究复杂组织中的细胞异质性和细胞间相互作用提供了强大的工具。

 

五、结果展开

图1. 显示实验流程示意图。

 

A：显示所有抗体首先通过IF测试，依据信号强度分配检测通道，验证后抗体被同位素标记，以备成像质谱细胞术（IMC）实验。
B：皮肤样本用38种金属标记抗体染色，以Hyperion IMC处理生成高维图像（40通道），细胞分割后转换为.csv和.fcs格式的带有空间信息单细胞数据文件。
C：根据标记抗体对上皮、血管、免疫和基质细胞进行分选，对目标细胞群进行选择和聚类分析，在分割图中进行可视化空间呈现，分析描述细胞间邻近关系，如细胞-细胞接触和微环境组成，对比分析对照和患者之间差异，并与临床表型相关联。
D：通过共定位检测（CODEX）和酪胺信号放大（TSA）这两种技术，对IMC空间蛋白质组学的发现进行验证分析。

 

图2. 展示SSc患者与对照之间血管内皮和淋巴管内皮细胞的差异变化。

 

A：展示使用FIJI和ImageJ软件统计的淋巴管或血管内皮细胞所覆盖的百分比。
B：展示淋巴管和血管内皮细胞的细胞计数。
C：展示H&E染色切片和基于成像质谱细胞术所鉴别的血管内皮细胞（VECs, V）、淋巴管内皮细胞（LECs, L）和周细胞（P），标记蛋白为组蛋白-3、CD31等。
D：UMAP分析展示划分细胞类型VECs和LECs（左），以及SSc与对照来源的细胞（右）。
E：热图展示每个聚类中标记物的平均蛋白表达水平。

 

图3. 描述血管内皮细胞（VEC）和淋巴管内皮细胞（LEC）的亚群聚类分析。

 

A：UMAP分析描述了VEC的7个不同亚群以及SSc与对照来源的细胞。
B：热图展示了VEC亚群标记物的平均蛋白表达水平。
C：热图展示了不同样本中VEC亚群的细胞密度。
D：展示了种水平中每个由PELORA检测到的簇中识别出的细菌种群的相对丰度热图。
E：热图展示了每个LEC亚群标记物的平均蛋白表达水平。
F：热图展示了不同样本中LEC亚群的细胞密度。
G：小提琴图展示了对照和患者样本之间LEC亚群比较分析。

 

图4. 显示系统性硬化症（SSc）样本中CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞（VECs）增加，内皮祖细胞（EPCs）减少。

 

A：热图显示了通过共定位检测（CODEX）分析的标记物表达情况。
B：小提琴图展示对照和SSc样本中CD34⁺-VEGFR2⁺-CD31⁺ 细胞亚群的对比。
C：小提琴图展示了对照和SSc样本中CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺细胞亚群的对比。
D：CODEX图像展示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺细胞亚群。
E：CODEX图像展示CD34⁺-VEGFR2⁺-CD31⁺细胞亚群。
F：TSA图像展示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺细胞亚群。
G：TSA图像展示CD34⁺-VEGFR2⁺-CD31⁺细胞亚群。

 

图5. 显示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞（VECs）和内皮祖细胞（EPCs）原位分析。

 

A：热图展示不同免疫细胞亚型与CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ VECs、EPCs或内皮细胞（ECWA）之间的细胞-细胞邻近关系。
B：H&E染色和IMC染色切片图像展示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞与免疫细胞的邻近分析。
C：H&E染色和IMC染色切片图像展示内皮祖细胞（EPCs）与免疫细胞的邻近分析。

 

图6. 展示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞（VECs）和内皮祖细胞（EPCs）微环境中免疫细胞。

 

A：小提琴图展示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞、内皮祖细胞和ECWA细胞三者CD45⁺免疫细胞数比较。
B：小提琴图展示SSc与对照样本中CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞微环境中CD45⁺免疫细胞数比较。
C：热图展示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞、内皮祖细胞和ECWA细胞三者中多类型免疫细胞数量对比。
D：饼图展示SSc样本中CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞（上）和EPC（下）浸润免疫细胞组成比例。
E：H&E染色和IMC染色切片图像展示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞周围免疫细胞。
F：H&E染色和IMC染色切片图像展示EPC周围免疫细胞。

 

图7. 展示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺血管内皮细胞（VECs）周围肌成纤维细胞的聚集以及内皮-间充质转化（EndMT）标记物的表达。

 

A：显示SSc样本中特定细胞亚群与肌成纤维细胞之间的细胞-细胞相互作用。
B：显示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺血管内皮细胞微环境中的肌成纤维细胞，相互作用网络（左）两者空间关系，IMC图像（右侧）展示了CD31、CD34和αSMA的表达。
C：热图展示共定位检测（CODEX）分析SSc样本中CD34⁺-αSMA⁺血管内皮细胞与其他血管内皮细胞进行内皮-间充质转化（EndMT）标记物表达情况。

图8.显示CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺ 血管内皮细胞（VECs）和内皮祖细胞（EPCs）与临床结果相关性分析。

 

A：热图展示所有VEC亚群的细胞密度与SSc不同临床结果之间的相关性。
B：显示SSc样本CD34⁺-αSMA⁺-CD31⁺血管内皮细胞密度与不同临床指标之间的相关分析，包括改良Rodnan皮肤评分（mRSS）进展、局限性系统性硬化症（lcSSc）或弥漫性系统性硬化症（dcSSc），早期SSc和晚期SSc、欧洲硬皮病试验与研究组（EUSTAR）疾病活动指数。
C：显示SSc样本内皮祖细胞（EPCs）密度与不同临床指标之间的相关分析，包括改良Rodnan皮肤评分（mRSS）进展、局限性系统性硬化症（lcSSc）或弥漫性系统性硬化症（dcSSc），早期SSc和晚期SSc、欧洲硬皮病试验与研究组（EUSTAR）疾病活动指数。

 

参考文献
Rius Rigau A, Li YN, Matei AE, Györfi AH, Bruch PM, Koziel S, Devakumar V, Gabrielli A, Kreuter A, Wang J, Dietrich S, Schett G, Distler JHW, Liang M. Characterization of Vascular Niche in Systemic Sclerosis by Spatial Proteomics. Circ Res. 2024 Mar 29;134(7):875-891. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.123.323299.