一、背景介绍

实际年龄和生物学年龄是评估年龄的两个概念：实际年龄是指自出生以来的时间长度；生物学年龄用来评估个体的生理状态，反映组织器官的健康。生物学年龄更为科学，它考虑了遗传环境、生活方式等多因素对个体衰老的影响，客观说明身体实际有多“老”，比实际年龄更能反映健康状况和剩余寿命。DNA甲基化时钟是一种有效工具，可以用来预测个体生物学年龄，本研究基于两个群体数据，拟开发适用于中国个体的衰老时钟。

二、材料方法

研究对象为Quzhou队列，包含112名女性和138名男性，年龄涵盖20岁到87岁，空腹采集15毫升全血，血液样本经处理后提取DNA。样本进行亚硫酸氢盐转化处理后，以Illumina平台的甲基化芯片进行检测。甲基化数据预处理使用ChAMP软件包进行背景校正、归一化处理、低质量位点过滤，生成标准矩阵，差异甲基化位点应用线性模型分析，识别与年龄相关的差异甲基化位点。

DNA甲基化时钟建立基于Quzhou队列数据，使用ElasticNet回归模型，选择65个CpG位点，其中35个位点随年龄上调，30个位点随年龄下调，时钟模型验证应用CAS队列数据来评估其预测准确性，并与其他甲基化时钟比较来评估其预测性能。多模态时钟数据整合包括结合其他组学数据和面部图像数据，构建多模态衰老时钟，使用留一法策略预测验证集中个体的多模态年龄。

三、结果讨论

研究揭示了与年龄相关的DNA甲基化变化，并建立了中国人群的DNA甲基化时钟（iCAS-DNAmAge）。结果发现随着年龄增长DNA甲基化水平发生显著变化，甲基化稳定性和一致性受到影响，其中包含了331个随年龄上调和1330个下调的差异甲基化位点，表明不同甲基化在基因表达调控中发挥不同的作用，在对特定基因的分析中，发现ELOVL2的甲基化随年龄增加而上升，而与免疫相关的ZC3H12D则表现甲基化下降。

该模型包含65个CpG位点，其中35个位点的甲基化水平随年龄增加而上升，其与蛋白泛素化相关，而30个位点则随年龄下降，主要与蛋白质磷酸化相关，模型预测准确性在Quzhou和CAS队列中分别为0.97和0.77，表现优于Hannum等模型。研究还综合了面部年龄、转录年龄等多因素，显示了与实际生物年龄之间表现出强相关性，能关联与健康相关的生活方式、疾病状态等多种指标，显示出其在评估生物年龄和衰老速率方面的潜力。

四、研究结论

随着国内老龄化日益加剧，理解衰老及生物标志物尤为重要，通过研究衰老相关的DNA甲基化时钟，可依此制定针对性的干预策略，促进公共健康发展。研究表明了DNA甲基化水平与年龄之间存在显著关联，揭示了衰老过程中DNA甲基化的动态变化，衰老时钟的建立，可更准确地评估生物年龄，为健康监测和疾病预防提供支持，强调健康生活方式在延缓衰老过程中的重要性。研究中数据处理方法确保了结果的准确可靠，通过多种组学数据的整合，提供了一个多维度的视角来理解衰老过程，为相关领域研究提供了可借鉴的框架。

五、结果展开

图1. 综合分析展示DNA甲基化随年龄变化。

A：研究流程示意图概述主要目标，包括识别与年龄相关的DNA甲基化特征，以及基于Quzhou和CAS队列建立的多模态DNA甲基化时钟（DNAm clocks）。
B：散点图展示DNA甲基化数据的主成分分析（PCA），颜色深度代表不同年龄段，反映年龄对DNA甲基化模式的影响。
C：散点图显示甲基化水平与实际年龄之间的相关性，Pearson相关分析计算相关系数和P值，表明甲基化水平与年龄之间存在显著线性关系。
D：散点图显示甲基化数据香农熵与实际年龄的相关性，揭示年龄增长会带来甲基化多样性和复杂性变化。
E：展示年龄相关的差异甲基化位置随年龄变化，热图中每一行代表一个甲基化位点，每一列代表一个个体，甲基化位点的类别标注在热图右上，环形图展示差异甲基化位点的定位。
F：滑动窗口分析了不同年龄段差异甲基化位点数量的变化，折线图展示了不同阶段DMPs的数量。
G：热图显示了35岁时特征值的变化，进一步强调了该年龄段的甲基化变化特征。
H：直方图展示了高龄相关甲基化变化区域的染色体分布，揭示了特定染色体在衰老过程中的重要性。
I：密度图展示了随着年龄增长，显著变化的甲基化位点在染色体上分布。LOESS拟合图展示了差异甲基化热点区域的平均甲基化变化，其中随年龄线性变化的甲基化位点被着色，其余位点为灰色，虚线表示平均甲基化beta值。

图2 甲基化组和转录组联合分析揭示了与衰老相关DNA甲基化引起的转录变化。

A：探针-基因对获取过程的示意图，探针-基因对是指用于检测特定基因甲基化状态的探针及对应的基因，通过探针周围的序列计算转录因子（TF）结合位点，并计算这部分基因在单细胞RNA测序数据中随年龄变化的程度。
B：热图和折线图展示了潜在的调控关系，包含了随年龄增长发生了甲基化下调的差异基因对，以及发生了甲基化上调的差异基因对。
C：箱形图展示年轻个体和老年个体单细胞RNA测序数据中差异基因GSVA分数的差异，GSVA指基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis），分数用于评估样本中基因集的活性程度。
D：条形图展示差异基因富集通路，下调的差异基因富集通路为蓝色，上调的为红色。
E：显示与Aging Atlas数据库中所重合的差异基因随年龄而变化的情况。
F：散点图显示转录因子结合位点基序分析，展示与转录相关的差异甲基化。
G：左侧散点图显示基序甲基化与结合该基序的转录因子表达之间的相关性，右侧条形图展示了可能由转录因子调控，且随年龄减少表达的基因富集通路。基序指短的重复核苷酸序列，通常作为转录因子的结合位点。

图3. 显示建立基于中国人群体的DNA甲基化衰老时钟模型。

A：显示建立DNA甲基化时钟的过程示意图，Quzhou队列被随机分为训练集（n = 125）和验证集（n = 125），使用弹性网络构建了DNA甲基化时钟。弹性网络是一种机器学习方法，结合了岭回归和LASSO的优点，用于变量选择和正则化。
B：散点图展示了iCAS-DNAm模型预测年龄与生理年龄的线性关系，分别在Quzhou队列和CAS队列中进行了验证，同时利用其他时钟模型进行了预测。
C：比较了不同时钟模型对Quzhou队列和CAS队列的预测性能，x轴对应Quzhou队列，y轴对应CAS队列。
D：热图展示了随着年龄增长CpG位点在时钟中的变化情况，每一列为一个基因，每一行为一个个体，圆形图展示了这些CpG位点的信息，不同颜色代表不同类型的位点，两者结合展示那些用于iCAS-DNAm预测的CpG位点。
E：条形图展示探针相关基因的富集通路，下调通路为蓝色，上调通路为红色。
F：维恩图展示不同时钟模型之间的在预测中重叠情况，下方热图显示了iCAS-DNAmAge模型与其他模型相重叠的甲基化位点随年龄变化情况。
G：示意图显示建立DNA甲基化时钟的过程，首先利用与其他模型重合的7个CpG位点进行线性回归拟合，然后利用逐步回归去除贡献值较低的位点，最终获得5个CpG位点用于拟合。
H：展示时钟模型预测年龄与实际年龄的相关性和平均绝对误差，左侧为Quzhou对列，右侧为CAS队列。

图4. 概述了基于DNA甲基化数据预测多模态衰老时钟的研究过程和结果。

A：展示了构建多模态甲基化时钟的流程，包括数据处理、模型训练和验证等步骤。
B：散点图依次展示多个模态甲基化时钟预测年龄与实际年龄的线性关系，多模态包括了复合年龄（Composite Age）、转录年龄（TransAge）、面部年龄（FacialAge）、蛋白质年龄（ProteinAge）、激素年龄（HormoneAge）、表型年龄（PhenoAge、代谢年龄（MetabAge）、免疫年龄（ImmuneAge）、脂质年龄（LipidAge）。
C：点图对比展示了不同模态时钟在Quzhou队列和CAS队列中的预测性能。

图5. 展示了基于DNA甲基化数据的衰老时钟与各种健康指标之间的关联。

A：示意图展示计算衰老速率的策略，利用多模态模型训练甲基化时钟，并基于实际年龄计算衰老步伐（pace），根据步伐值将个体分为加速衰老组和减速衰老组。
B：左侧的散点图显示了衰老步伐与预测年龄/实际年龄的相关性，中间的密度图展示了年龄加速和减速组的分布情况，右侧箱形图展示了年龄加速组和减速器组之间的一些指标差异，比如细胞外液/总身体液（ECF/TBF）和细胞外水/总身体水（ECW/TBW）。
C：山脊图展示加速衰老组和减速衰老组的生活方式因素差异，比如腌制食品、油炸食品、睡眠时间等。
D：箱形图和散点图展示疾病状况，比如高血压、高血脂、糖尿病，对时钟模型以及衰老速度的影响。
E：示意图概述了三种类型的年龄与它们的加速\减速因子，总结了多种因素参与影响不同时钟模型，比如葡萄柚可以减缓面部年龄变化，油炸腌制食品加速复合年龄变化等。

参考文献：

Zheng Z, Li J, Liu T, Fan Y, Zhai QC, Xiong M, Wang QR, Sun X, Zheng QW, Che S, Jiang B, Zheng Q, Wang C, Liu L, Ping J, Wang S, Gao DD, Ye J, Yang K, Zuo Y, Ma S, Yang YG, Qu J, Zhang F, Jia P, Liu GH, Zhang W. DNA methylation clocks for estimating biological age in Chinese cohorts. Protein Cell. 2024 Jul 20;15(8):575-593. doi: 10.1093/procel/pwae011. PMID: 38482631; PMCID: PMC11259550.