胃癌（GC）是全球第五大常见癌症原因，也是癌症相关死亡的第三大原因。这些高死亡率主要归因于大多数GC患者是在疾病相对晚期时被诊断出来的。事实上，在肿瘤仍符合手术切除条件的情况下检测早期GC（EGC）可以将患者的生存率提高到70%，而晚期GC 患者的生存率则相对惨淡，仅为20%。在中国和其他GC发生率高的国家，常规的大规模筛查目前依赖于内窥镜检查。然而，这种筛查经常因患者依从性差和潜在并发症的风险而受到批评，提示了需要开发替代生物标志物以早期发现这种GC的必要性。

      许多研究强调了循环细胞外囊泡（EV）中高浓度长链非编码RNA（LR）的潜在临床意义，并且已将几种EV衍生的LR候选药物确定为潜在的诊断生物标志物。EV的LR图谱与组织和循环细胞的图谱不同，其提供了不同的生物学意义。先前的研究表明，lncRNA GClnc1具有功能致癌作用，能够促进肿瘤进展。由于LR在组织、血液、粪便和其他体液中的表达通常稳定，因此它们已成为开发人类癌症液体活检生物标志物的有希望的标的。

方法学

      本研究纳入了2141名患者，包括888名GC患者、158名慢性萎缩性胃炎患者、193名肠上皮化生患者、501名健康供体和401名其他胃肠道癌症患者。在发现阶段使用转录组学分析了I期GC组织样品的LR谱。细胞外囊泡（EV）衍生的LR特征通过训练队列（n = 554）进行鉴定，并通过2个外部队列（n = 429 和 n = 504）和补充队列 （n = 69）进行验证。

结论

      在发现阶段，发现一个LR（GClnc1）在组织和循环EV样本中均上调，早期GC（I/II 期）的曲线下面积（AUC）为 0.9369（95% 置信区间 [CI]，0.9073–0.9664）。该生物标志物的诊断性能在2个外部队列中进行了验证（西安队列，AUC：0.8839;95%CI：0.8336–0.9342;北京队列，AUC：0.9018;95% CI：0.8597–0.9439）。此外，EV 衍生的 GClnc1 可有效区分早期 GC 与癌前病变（慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生）以及传统胃肠道生物标志物（CEA、CA72-4 和 CA19-9）阴性的GC。该生物标志物在术后和其他胃肠道肿瘤血浆样本中的低水平表达表明其具有对GC的特异性。

结果 1

全基因转录组学分析确定了用于检测EGC患者的特征LR

      本研究的第一个目标是确定用于检测EGC系统和全面的LR特征。为此，使用来自美国癌症联合委员会 I 期 GC 患者的组织样本（n = 10 对）。每个样本都检测了近 14,000 个注释基因，包括信使RNA、LR 和假基因。检测到的RNA种类数量在肿瘤和正常粘膜样本之间没有显着差异（下图A）。三维数据散点图表明，肿瘤样本的转录组学图谱通常与正常粘膜样本的转录组学图谱不同（下图B）。与使用 Mann-Whitney U 检验的正常粘膜样本相比，总共鉴定出2个LR在肿瘤样本中表达有差异。差异表达的LR与癌症相关的一些通路有关，例如胃癌通路、mTOR信号通路和P2信号通路（下图D）。

      为了提高已发现生物标志物的整体特异性，将5个最优的LR候选者与6个公共分析数据集（GSE26595、GSE33743、GSE23739、GSE70880、GSE28700 和 GSE93147）进一步比对，随后鉴定了3 个 LR（GClnc1、GCMA 和 MT1JP），它们代表了EGC患者中上调的标志物。最后，多变量logistic回归模型展现了此3-LR panel在EGC患者中的性能，其诊断AUC值为0.9257（95%置信区间[CI]，0.9011–0.9502;P < 0.0001），对患者EGC检测的敏感性为86.31%，特异性为83.52%（图2F）。这些结果表明，这种 3-LR panel 具有作为检测 EGC 的生物标志物的潜力。

结果 2

在独立队列中，建立和验证LR panel 在EGC患者中的诊断性能

      首先本文研究了在发现阶段鉴定的基于组织的标记是否可以在无细胞血浆中检测到。令人失望的是，GC血浆样本中的3个LR候选者与HD样本没有显着差异，并且显示出与HD一样低的水平。

      循环游离lncRNA GClnc1主要封装在EV内，在分析EV耗尽的血浆时，这种lncRNA的水平显着降低（P<0.0001）。此外，EV衍生的lncRNA GClnc1与lncRNA GClnc1的总循环游离水平显著相关（r=0.7246;P < 0.0001）。这些结果有力地证明了这种基于组织的标记物lncRNA GClnc1可以在具有EV封装形式的血浆样品中检测到。

      接下来，为了确定EV衍生的lncRNA GClnc1对EGC的诊断潜力，使用qPCR检查了其在1个独立临床队列中从血浆样本获得的性能。该生物标志物在一组患者（112 名 EGC 和 159 名 HD）中进行了训练。与HD相比，EGC患者样本中EV衍生的lncRNA GClnc1和3种测试的胃肠道肿瘤相关生物标志物（CEA、CA72-4和CA19-9）水平均显著升高（P<0.05;下图A–D）。然而，EV 衍生的 lncRNA GClnc1 在 EGC 患者中表现出出色的诊断性能，AUC 值为 0.9369 （95% CI， 0.9073–0.9664;P < 0.0001），相应的灵敏度为87.42%，特异度为84.82%，显著高于CEA（AUC，0.6831;灵敏度，83.65%;特异性，49.11%），CA72-4（AUC，0.6204;灵敏度，74.84%;特异性，50.00%）和CA19-9（AUC，0.6066;敏感性，59.12%;特异性，58.04%;下图E-H）。

      由于EV衍生的lncRNA GClnc1在训练队列中检测EGC的结果令人鼓舞，后续在西安（142个EGC和93个HD）和北京（108个EGC和108个HD）的2个外部独立验证队列中进一步评估了该生物标志物的稳健性和准确性。西安队列的敏感性为 89.81%，特异性为 78.49%，AUC 值为 0.9018（95% CI，0.8597–0.9439;P < 0.0001），北京队列的敏感性为 89.44%，特异性为 80.56%。3 种传统胃肠道生物标志物在两个外部验证队列中显示出较低的 AUC值、敏感性和特异性。

结果 3

lncRNA GClnc1 可靠地区分EGC和癌前病变

      众所周知，有效生物标志物的一个重要特征是可以区分早期癌症和癌前病变。因此，本文研究了EV衍生的lncRNA GClnc1是否可以区分EGC和胃癌前病变（慢性萎缩性胃炎[CAG]和肠化生[IM]）。令人兴奋的是，在西安验证队列中，该生物标志物在区分EGC与CAG和IM时保持了出色的诊断性能，AUC值为0.8523 (95% CI, 0.7921–0.9126; 敏感性, 85.19%; 特异性, 73.12%) 和0.8401 (95% CI, 0.7718–0.9084; 敏感性, 85.71%; 特异性, 74.19%)。同样的，在北京验证队列中，该生物标志物则显示出更好的诊断性能，AUC值为0.8702 (95% CI, 0.8131–0.9274; 敏感性, 86.49%; 特异性, 79.63%) 和 0.8510 (95% CI, 0.7907–0.9113; 敏感性, 84.38%; 特异性, 80.56%)。相比之下，传统的胃肠道生物标志物 CEA、CA4-72 和 CA4-19 在两个外部验证队列中都未能达到令人满意的敏感性和特异性以区分 EGC 和癌前病变。

结果 4

lncRNA GClnc1 可识别早期（I/II 期）和晚期（III/IV 期）GC患者

      改善GC患者预后的一个重要方法是获得早期诊断。本文已经确定了EGC的诊断价值，进一步验证这种生物标志物是否可以应用于晚期GC（AGC;III/IV期）。在西安验证队列中，基于lncRNA GClnc1在EGC与AGC中的相对分布，该生物标志物成功地识别了EGC和 AGC 患者。此外，该生物标志物在检测AGC方面显示出优异的诊断性能，AUC值为0.8910 (95% CI, 0.8500–0.9320; 敏感性, 85.78%; 特异性, 83.21%)，优于其他3种胃肠道肿瘤相关生物标志物（CEA：AUC，0.8060;敏感性，77.29%;特异性，76.34%;CA72-4：AUC，0.7012;灵敏度，82.61%;特异性，59.54%;CA19-9：AUC，0.6926;灵敏度，71.98%;特异性，56.49%;下图5A-D）。同时，在北京验证队列中，该生物标志物在检测AGC方面也保持了优异的诊断性能，AUC为0.8978（95%CI，0.8642-0.9314;灵敏度，90.53%;特异性，76.47%），优于CEA（AUC，0.6616;灵敏度，76.54%;特异性，48.37%），CA72-4（AUC，0.6642;灵敏度，79.01%;特异性，51.63%）和CA19-9（AUC， 0.5823;灵敏度，65.43%;特异性，48.37%;下图E- H）。2个外部验证队列的校准曲线保持稳定。

结果 5

lncRNA GClnc1 能有效识别传统胃肠道肿瘤相关生物标志物阴性的GC患者

      据报道，20%-40%的GC患者传统胃肠道生物标志物（包括 CEA、CA72-4 和CA19-9）阴性，生物标志物有必要识别这个亚组的GC患者。对于西安验证队列中胃肠道生物标志物阴性的GC患者，EV衍生的lncRNA GClnc1在区分这些肿瘤与癌前病变和HD样本时显示出很高的诊断效率（下图11 A-11 D)。与这些结果一致，在北京验证队列中，该生物标志物在识别胃肠道生物标志物阴性患者方面同样保持了出色的诊断性能（下图11 E-11 H）。此外，2 个外部验证队列的校准曲线仍然保持稳定。总之，这些结果揭示了 EV 衍生的 lncRNA GClnc1 在识别胃肠道生物标志物阴性的 GC 患者亚组方面具有稳健性。

参考文献

Guo X, Peng Y, Song Q, Wei J, Wang X, Ru Y, Xu S, Cheng X, Li X, Wu D, Chen L, Wei B, Lv X, Ji G. A Liquid Biopsy Signature for the Early Detection of Gastric Cancer in Patients. Gastroenterology. 2023 Aug;165(2):402-413.e13. doi: 10.1053/j.gastro.2023.02.044. Epub 2023 Mar 7. PMID: 36894035.