结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是全球癌症死亡的第二大常见原因。诊断时的癌症分期作为最重要的预后因素，相当程度上决定了患者的临床结局。早期诊断与更好的预后以及更长的生存期有关。同时，靶向治疗和免疫治疗的广泛使用正在改善结直肠癌的结局。生物标志物的诊断是早期发现肿瘤和预测治疗反应的关键。目前，粪便血红蛋白的免疫组化检测可能是最广泛的CRC诊断生物标志物，且还有不少生物标志物处于临床使用前的研究验证阶段。本文重点关注了这些生物标志物背后的证据，以及它们当前和未来的应用价值。

 

背 景

      从1990年到2019年，全球CRC发病率从842,098例上升到217万例，CRC相关死亡人数从518,126例增加到109万。与此同时，“早发性”CRC病例有所增加，其被定义为被诊断出年龄小于50岁的患者。1期CRC患者的5年生存率为92%，而4期CRC的5年生存率降至10%。可以说，疾病早期诊断CRC是影响疾病预后的最重要因素，高于疾病级别或患者特征。大多数结直肠癌患者一旦出现症状就会被诊断出来-如出现排便习惯改变、直肠出血或贫血；但多项研究表明，一旦出现这些症状，患者通常处于预后不良的晚期。

      结肠镜筛查无症状患者已被证明可以发现早期CRC并降低CRC相关死亡率，但这受到经费（特别是在公共卫生系统中）以及患者态度和接受率的限制。这提示ag真人平台官方可以将更多的工作重点放在无症状患者群体上，以期早期诊断CRC和高危腺瘤，这些腺瘤被认为是侵袭性CRC的前兆。

      生物标志物是可以作为病理过程和疾病活动信号的分子或化合物。在与CRC相关的诊疗中可以起到以下作用，1）早期诊断，2）提示预后和治疗方案，3）疾病复发监测。在过去的20年中，预后生物标志物取得了长足进展，特别是来自肿瘤组织的遗传和表观遗传生物标志物，如KRAS和BRAF突变，可以指导个体患者的肿瘤治疗。

      相比之下，直到最近，用于早期诊断的生物标志物的临床应用一直受到严重限制，这主要是由于对疾病缺乏足够的敏感性和特异性。然而，自2020年以来，许多国家越来越多地采用粪便免疫化学检测（faecal immunochemical test， FIT）来指导筛查项目和对患者进行风险分层以进行调查。但FIT仍然不完善，假阳性和假阴性比结肠镜检查更多，因此，需要对几种潜在的生物标志物进行研究对，以提高早期CRC诊断率。

 

结论

      FIT作为一种非侵入性CRC生物标志物，在世界范围内迅速受到关注，但同样清楚的是，孤立地使用FIT是不够的，ag真人平台官方还有多种其他潜在的生物标志物。与侵入性和病态结肠镜检查相比，FIT的上升可能有助于打破这些生物标志物进展的障碍，使非侵入性生物标志物的使用更容易被患者和临床医生接受和信任。

      许多问题仍然需要回答。例如，血液检查、粪便检查、尿液检查或呼气测试对患者来说更容易接受什么？这甚至可能因不同的文化或世界不同地区而异。成本是另一个关键考虑因素。这些生物标志物应该比结肠镜检查便宜得多，以便在不影响患者安全的情况下为公共卫生系统节省资金，这适用于ag真人平台官方讨论过的大多数检测。

      同时，所有研究都存在“前体病变”或高危腺瘤的诊断准确性降低。这也是FIT的一个缺点。

      Mi-RNA和VOCs在比其他生物标志物更高的灵敏度方面脱颖而出。此外，通过尿液或呼气对挥发性有机化合物进行采样分析的潜力很有吸引力。同时，miRNA、mSEPT-9 和 ct-DNA 也不应被忽视，它们对 CRC 表现出更高的特异性和阴性预测值。

      在实践中，一个合理的测试组合可能被证明可以提供最佳的诊断准确性，但这应该与成本和时间相平衡。未来将需要进一步的前瞻性研究，以研究这些非侵入性CRC生物标志物来回答以上这些问题。

 

结果 1

粪便免疫化学检测（FIT）

      虽然这不是本文的主要重点，但将FIT作为生物标志物的参考标准是有用的。FIT现已成为CRC的主要生物标志物。2021年一项纳入9800例患者的研究显示，在检测限以内，CRC的敏感性为97%（95%CI 94.5-98.5%），在同一阈值下，阴性预测值为99.8%（95%CI 99.7-99.9%）。目前，它已被纳入英国无症状患者筛查和有症状患者诊断的国家指南。北美、德国、荷兰、比利时和意大利等欧洲大部分地区以及澳大利亚也正在采用它作为筛查的一部分。

      然而，在上述研究中，它并不完美，它在阈值极限下的特异性仅为 64.9%（95% CI 63.9–65.8%），阳性预测值仅为 8.7%（95% CI 7.8–9.7%）。

      因此仍然迫切需要寻找其他可靠的生物标志物和潜在的测试组合，以与结肠镜检查的黄金标准相媲美。

 

结果 2

蛋白质生物标志物

      CRC 的蛋白质生物标志物存在于粪便、血清和血浆中。在粪便中，主要的蛋白质生物标志物是血红蛋白——它是通过FIT测量的。下表给出了血清和血浆蛋白生物标志物的列表，下面将详细地描述了最重要的蛋白质生物标志物。

2.1. 癌胚抗原（CEA）

      CEA是最知名的蛋白质生物标志物之一，也是英国目前唯一使用的CRC血清检测。它是一种胎儿糖蛋白，由Gold和Freedman于1965年从CRC组织中分离出来，并且仅在某些疾病状态（包括CRC）的血清中显着检测到。不幸的是，它不够特异性或敏感性，无法用作特定的CRC诊断生物标志物，并且在许多其他疾病（如炎症性肠病或胰腺癌）中升高。然而，它可用于CRC的治疗后监测，并可提醒临床医生注意疾病复发的可能性。

 

2.2. CA 19-9

      癌症抗原19-9 （Ca 19-9） 是1979年发现的另一种糖蛋白。它最常用作胰腺癌的“肿瘤标志物”，对CRC的敏感性较低，范围为26%-48%。与 CEA一样，它对 CRC 的特异性也不够--在糖尿病、支气管扩张或肝硬化等良性过程中可见 Ca 19-9 升高。在胰腺癌、胆管癌、胃癌和肺癌中也有发病。因此，这种生物标志物在结直肠癌中几乎没有用处。

 

2.3. 基质金属蛋白酶 （MMP） 和金属蛋白酶组织抑制剂 （TIMPS）

      基质金属蛋白酶 （MMP） 是一类蛋白水解酶，主要参与人体组织细胞外基质 （ECM） 的降解。它们可以分解胶原蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白等蛋白质，导致组织降解并为新组织的形成让路。在正常情况下，它们的活性受到其他分子的严格调控，这些分子被称为金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）。

      在结直肠癌中，MMP活性的这种平衡被破坏，ag真人平台官方可以看到这些酶的表达和激活增加，导致肿瘤扩散的特征，如血管生成、组织浸润和转移。

      一种特殊的理论认为，MMP/TIMP失调是CRC癌变的早期事件，因此可能对早期诊断具有价值。1990年代的研究还显示，CRC等癌症患者的MMP和TIMP水平升高。

 

2.3.1. 基质金属蛋白酶-9（MMP-9）

      Hurst等进行了第一项研究，将血清MMP-9浓度作为潜在的生物标志物进行研究，入组患者中包括63例CRC患者。报告的敏感性和特异性分别为77.9%和77.1%。

      五年后的2012年，Wilson等在这项工作的基础上，对748例初级保健中出现下消化道症状的患者进行了一项前瞻性研究，其中46例被确定为CRC病例。使用逻辑回归模型，他们发现血清MMP-9对CRC的敏感性为79%，特异性为70%。

      在这些初步有希望的结果之后，至少进行了10项其他研究。2018年发表了唯一一篇关于MMP-9诊断准确性的meta分析，分析了12篇关于血清MMP-9对CRC诊断价值的论文，估计合并敏感性和特异性分别为69%和68%。

      有趣的是，Annahazi等在2016年的一项初步研究表明，ELISA检测到的粪便MMP-9能够区分CRC和对照组患者，敏感性为89.3%，特异性为91.2%。

      许多其他研究将 MMP-9 和其他 MMP 视为预后生物标志物，而不是用于早期诊断。

      总而言之，自早期有希望的研究以来，MMP-9 最近没有进一步进展，并且在单独考虑时没有达到诊断生物标志物所需的水平。然而，如果与其他生物标志物结合使用，它可能会有一些希望，也许需要更多的工作来研究粪便MMP-9的价值。

 

2.3.2. 金属蛋白酶-1 （TIMP-1） 的组织抑制剂

      在人类中，TIMP 家族有4个已知成员——TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4。理论上，TIMP 以 1：1 的比例与 MMP 结合，以尝试降低其蛋白水解活性。因此，ag真人平台官方预计在MMP表达增加的CRC状态下，ag真人平台官方预计TIMP水平也会升高。

      TIMP-1 在生物标志物潜力方面的研究最多;并通过阻断MMP-9抑制血管生成。

      2018年，Meng等发表了一项meta分析，研究了所有评估TIMP-1作为早期诊断、非侵入性筛查工具作用的现有研究。

      纳入了2002年至2014年间的9项研究，共纳入了819名CRC患者。合并敏感性为65%（95%CI 57-72%），合并特异性为87%（95%CI 76-94%），受试者工作特征曲线下面积（AUROC）为0.77（95%CI 0.73-0.81）。

      Nielsen等对4509例有症状的患者进行了前瞻性研究，该研究未纳入上述meta分析，该研究纳入了4509例有症状的患者，这些患者被转诊到医院接受下消化道检查。本研究分别和联合观察了血清 CEA和TIMP-1，发现AUROC为 0.7（95% CI 0.67–0.73），如果与 CEA 测量相结合，则增加到0.75（95% CI 0.7–0.81）。

      与MMP一样，从那时起，研究似乎已经逐渐减少，此后没有发表任何荟萃分析。TIMP-1 对 CRC 的敏感性似乎也低于 MMP-9，而且在孤立方面也不够好。

 

结果 3

循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA

      循环肿瘤细胞 （CTC） 是从原发肿瘤分离并进入血液的癌细胞。它们可以传播到身体的其他部位，并可能建立新的转移性肿瘤[30]。首先对CTCs表现出兴趣，将其作为预后而非诊断性生物标志物，Veyrune等在2021年进行的一项系统评价表明，大多数研究都研究了CTC作为预后生物标志物的作用。因此，它们作为诊断生物标志物的前景目前仍然是坚定的假设。

      循环肿瘤脱氧核糖核酸 （ctDNA） 是从肿瘤细胞释放到血浆中的 DNA 片段。所有细胞都会向血液中释放少量脱氧核糖核酸（DNA），称为游离DNA（cell free DNA， cfDNA），但ctDNA是不同的，具有表观遗传特征和肿瘤特异性突变，可在外周血样本中检测到。与CTC一样，大多数研究都集中在ctDNA的预后效用上。话虽如此，Min等人发表了一项meta分析，从2011年到2020年共纳入了12项研究，计算出合并敏感性为72.3%（95%CI 62.3-80.3%），合并特异性为92.0%（95%CI 82.7-96.6%）。AUROC为0.86。本研究的主要缺点是研究之间存在显著的异质性，敏感性的I2值为87.5%。meta分析中纳入的大多数研究来自东南亚的中心。

      目前，在英国，一项名为NHS-Galleria试验的多癌种ct-DNA检测的试点研究正在招募患者。将招募 140,000 名无症状个体，其中一半将为多癌早期检测测试献血，以查看该测试是否可以减少该患者群体中诊断出的晚期癌症数量，包括 CRC。

      总之，CTC不能作为诊断生物标志物，但血清或血浆ctDNA具有潜在的诊断价值，研究正在进行中。现在，ag真人平台官方引出了一种特定的DNA相关生物标志物，称为甲基化Septin-9（mSEPT-9），显示出早期CRC检测的前景。

 

3.1. 甲基化SEPTIN-9 （MSEPT-9）

      ag真人平台官方知道，导致CRC的主要分子机制主要有三种——染色体不稳定性（CIN）通路、微卫星不稳定性（MSI）通路，最后是CpG岛甲基化表型（CIMP）通路。

      详细阐述CIMP途径 -- DNA中有一些富含CpG二核苷酸的特定区域，称为“CpG岛”。这些 CpG 岛的高甲基化与肿瘤抑制基因的丢失和致癌基因的激活有关，从而导致 CRC 的发展。这在编码蛋白Septin-9的基因中尤为明显，在2011年的一项研究中首次发现与CRC有显著关联。

      有许多研究着眼于mSEPT-9作为早期CRC生物标志物的价值，而不是其他蛋白质生物标志物或ctDNA。

      2020年，meta分析中关于结直肠癌患者mSEPT-9的最新meta分析。本研究综合了来自亚洲、欧洲和北美的 19 项病例对照研究。共有2113例CRC病例和5516例对照病例。总体合并敏感性为69%（95%CI [62-75%]），合并特异性为92%（95%CI [89-95%]）。他们还计算出平均风险人群的阴性预测值为99.9%，与FIT相当。研究之间再次证明了异质性，特别是在世界不同地区使用的阈值方面。

      此外，mSEPT-9 对前体病变（如高危腺瘤）的敏感性和特异性降低。

      因此，ag真人平台官方可以看到血清mSEPT-9 作为早期 CRC 的生物标志物确实具有重要的前景。同样，69%的灵敏度是不可接受的，但它可以构成生物标志物组合的一部分，需要对这一途径进行更多的研究。

 

结果 4

多靶点粪便DNA检测（mt-sDNA）

      多靶点粪便DNA检测（multitarget s粪便DNA检测， mt-sDNA）涉及对粪便样本进行检测，以识别已知与CRC和癌前状态（如高危腺瘤）相关的异常DNA序列。

      这种最出名的检测是由Cologuard™ 销售的，包括 KRAS 和 NDRG4 突变、BMP3甲基化和β-肌动蛋白的分子检测。它还包括针对人血红蛋白的非DNA免疫化学测定，类似于FIT 测试。将各种检测的结果结合起来，得出一个分数，该分数可以根据预设阈值进行测量，从而给出CRC的可能性。这种测试的优点在于内置了人血红蛋白检测功能，理论上应该优于FIT。

      Imperiale等于2014年发表了一项前瞻性评估Cologuard™的最大研究，研究了9989例无症状患者，其中65例CRC和757例高危息肉。在这项研究中，Cologuard™与FIT进行了直接比较，他们报告说DNA测试的敏感性为92.3%，而单独FIT的敏感性为73.8%。然而，FIT的特异性更高，特异性为94.9%，而DNA检测为86.6%。

      此后不久，西班牙一个研究小组发表了一篇小型系统评价，总结了5项关于Cologuard的研究，再次得出结论，Cologuard™具有足够的潜在敏感性，但不如粪便潜血试验具有的特异性。

      2017年，德国的一项研究比较了FIT与Cologuard™的性能，发现FIT的敏感性和特异性高于粪便DNA检测。然而，患者群体是分开进行FIT和粪便DNA检测分析的。该研究的一个有效观点是，Cologuard™ 的成本几乎是 FIT 测试的 20 倍，但额外的成本没有带来更多获益。

      然而，还有另一种名为ColoAlert™的检测方法，它更便宜，但只有一项队列研究报告的敏感性低于Cologuard™，而且这项研究没有直接与FIT结果进行比较。

      mt-sDNA检测的进展情况可以用欧洲一个研究小组今年进行的卫生技术评估（Health Technology Assessment， HTA）来概括——粪便DNA检测对CRC的敏感性可能略高，但对CRC的特异性较差。同时，研究患者选择的偏倚风险也存在疑问，癌前病变的诊断准确性仍然比FIT差。成本增加了近 30 倍。此外，这些研究没有彻底报告检测失败率，这可能会进一步增加成本。

 

结果 5

microRNA（miRNA）

      MicroRNA是微小的非编码分子，可影响细胞中靶基因的表达，从而调节各种生物过程。自 2008 年以来，ag真人平台官方已经知道它们以高度稳定、游离的形式存在于外周血样本中，包装在称为外泌体的复合物中。ag真人平台官方还知道，它们可以表现为肿瘤抑制因子或致癌基因，这取决于它们影响的特定DNA序列。例如，促进细胞生长和血管生成的miRNA可能导致癌症的发展，这些miRNA可能在CRC患者中检测到的含量更高;导致它们作为生物标志物的潜在用途。通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测它们。数据还显示，某些miRNA在CRC患者的血浆和组织中升高，然后在手术治疗后血浆水平继续下降。

      MiRNA数量众多且复杂。有超过 2000 种不同的 miRNA，据估计它们调节人类基因组的 30%。miRNA失调也与多种癌症有关，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌和肝癌。已知某些miRNA与CRC特异性相关。

      Sur等于2022年发表了一项meta分析，该分析提供了迄今为止关于miRNA作为CRC诊断生物标志物的最现代文献综合。

      综合了 2010 年至 2021 年间发表的 20 项观察性研究进行定量分析。大多数研究在中国（n = 12），然后是西班牙和美国（n = 2），其次是在韩国、波兰、捷克共和国和瑞典各进行1项研究。meta分析纳入了3339例CRC病例和2468例对照。主要发现是合并敏感性为85%（95%CI 84-86%），合并特异性为79%（95%CI 78-80%）。AUROC为0.915（95%CI [0.914–0.916]）。

      然而，应该指出的是，研究之间存在显著的异质性。每项研究使用的miRNA panel都不同，有些研究着眼于上调的miRNA，有些则着眼于下调的miRNA。样品类型主要是血清或血浆，但也可能是全血、唾液或粪便。所研究的种族人群也不同，这被证明会影响miRNA水平。

      上述研究提示了miR-15b、miR-21和miR-31，展望未来，应缩小CRC miRNA的检测范围，并使用标准panel。

      总而言之，在所进行的研究中，miRNA似乎显示出对CRC的高敏感性和特异性的重大前景，特别是在亚洲人群中，但限制因素是高危息肉的数据有限，检测产品的非标准化。在临床实践中推广之前，需要进一步的研究来弥合这些知识差距。

 

结果 6

挥发性有机化合物（VOC）

      挥发性有机化合物（VOCs）是在室温下以气态存在的碳基分子。它们以各种体液和气体的形式从人体中排出，例如呼吸、汗液、尿液和粪便。它们很重要，因为某些VOC是某些代谢过程的副产物，在疾病状态下可以上调，比如癌症。

      自 1920 年代以来，ag真人平台官方已经知道癌细胞比其他细胞更具代谢活性，葡萄糖摄取增加，乳酸产生更多，这被称为 Warburg 效应。这对于肿瘤的生长和吸收更多的生物量很重要，事实上，一些最常见化疗药物正是针对癌细胞这一特征的，例如抗代谢药物，如5-氟尿嘧啶，其是用于治疗CRC和其他胃肠道癌症的关键药物之一。

      因此，从逻辑上讲，与正常组织相比，癌症组织的代谢物在组成或丰度上会有所不同，这反过来又会驱动癌组织排放的 VOC。癌细胞释放的挥发性有机化合物会存在于结直肠癌患者的粪便中，但也会被吸收到血液中，然后通过呼吸呼出或随尿液排出体外。因此，它们可以作为CRC生物标志物进行采样和检测。

      1989年，Williams和Pembroke发现，嗅探犬可以被训练来识别恶性黑色素瘤的气味，Sonoda等在2011年进行了跟进，他们在一项小规模研究中证明，犬的嗅觉可以检测CRC样本，其灵敏度和特异性分别为97%和99%。这代表来自CRC样本的VOC与狗鼻子中的受体结合并向它们的大脑发送信号;导致模式识别。

      Peng等于2010年发表了一篇关于VOC研究的重要论文，该论文基于纳米传感器阵列被证明可以区分肺癌、结直肠癌、乳腺癌或前列腺癌患者的呼吸。

      挥发性有机化合物有一系列不同的测量技术。诺贝尔奖获得者化学家莱纳斯·鲍林（Linus Pauling）首先使用一种称为气相色谱法（GC）的技术描述了尿液和呼气中VOC的定量测定。GC 可以与质谱 （MS） 结合使用，以更准确地定义 VOC 量，称为 GC-MS。此后，其他分析技术不断发展，如SIFT-MS、IMR-MS和FAIMS。

      自 2010 年以来，许多研究都将 VOC 视为 CRC 生物标志物，但很明显，目前还没有一种 VOC 强烈指示 CRC，VOC 研究的所谓“圣杯”尚未被发现或其根本不存在。相反，最受关注的理论是，整体VOC特征的变化是显著的，并且与疾病状态下体液气味的变化一致。

      2019年，Hanna等发表了一项meta分析，分析了63项研究，研究了呼吸VOCs在所有癌症诊断中的效用，包括肺癌、乳腺癌、胃食管癌、结直肠癌等。该研究发现，其合并敏感性为79%（95%CI 77-81%），合并特异性为89%（95%CI 88-90%），但其仅纳入了4篇分析CRC的论文，并且没有进行亚组分析。

      2021年，Chandrapalan等发表了一项关于结直肠癌中所有样本的VOC的meta分析，得出了15项研究，包括5项呼吸研究、5项粪便研究和5项尿液研究。合并敏感性为 83.7%（95% CI 78.1–88.1%），合并特异性为 80.3%（95% CI 71.2–87.0%）。AUROC为0.885。

      此外，van Liere等发表了一项meta分析，纳入了16项研究，研究了CRC中的尿液VOCs。综合了 1618 例对照组、837 例 CRC 和 266 例高危腺瘤，合并敏感性为 84%（95% CI 73-91%），合并特异性为 70%（95% CI 63-77%）。与Chandrapalan的研究一样，这项荟萃分析表明，FIT阴性和VOC检测阴性将导致CRC诊断的机会显着降低。

      展望未来，很明显，VOC 作为潜在的 CRC 生物标志物是令人鼓舞的，但人们也认为，需要对诊断准确性进行更大规模的前瞻性研究，以评估它们准确检测高风险腺瘤的能力。

 

参考文献

Krishnamoorthy A, Arasaradnam R. Colorectal cancer diagnostic biomarkers: Beyond faecal haemoglobin. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2023 Oct;66:101870. doi: 10.1016/j.bpg.2023.101870. Epub 2023 Sep 23. PMID: 37852713.