每年的4月17日为“世界血友病日”，血友病（Hemophilia）是一种遗传性凝血障碍疾病，患者凝血因子缺乏，血液凝固障碍，易于出血，比如血友病A和血友病B，即由于凝血因子VIII和凝血因子IX的缺乏而引起。

　　目前临床治疗为补充相应凝血因子，但患者会产生抗药物抗体（Anti-drug antibodies，ADA），大大降低治疗效果。因此找到预防ADA的方法可以改良注射效果。

　　01研究目标

　　本研究的假设是通过口服抗原耐受策略，诱导产生调节性T细胞（Regulatory T cells，Treg），从而抑制ADA的形成。具体来说，研究假设口服抗原能够激活特定的免疫细胞群体，尤其是Treg细胞，这些细胞通过分泌免疫抑制因子和/或细胞接触依赖的机制，抑制免疫系统对治疗性凝血因子的攻击，从而减少ADA的产生。

　　02研究方法

　　1.研究者使用血友病小鼠模型，模拟血友病A（FVIII缺失）和血友病B（FIX缺失）。

　　2.通过基因工程技术制备表达人类凝血因子FVIII或FIX片段的生菜细胞。

　　3.实验组先口服含凝血因子片段生菜，后接受凝血因子注射；对照组仅后期接受注射。

　　4.流式细胞术分析小鼠脾脏中的T细胞亚群。

　　5.单细胞测序分析特定的T细胞亚群。

　　6.数据分析合揭示Treg细胞亚群的基因表达特征和功能差异。

　　7.功能实验检测Treg细胞分泌的免疫抑制因子，如IL-10和TGF-β；评估不同Treg细胞亚群对常规T细胞的抑制。

　　03研究结果

　　口服抗原策略诱导出三种不同的Treg细胞亚群，通过分泌免疫抑制因子和细胞接触依赖的方式，抑制ADA形成。特别是FoxP3-LAP+Treg细胞亚群，显示出强大免疫抑制能力，可诱导普通T细胞转化。

　　单细胞测序揭示了Treg细胞亚群的转录特征，如FoxP3+LAP+细胞表现出激活的Treg细胞表型，而FoxP3-LAP+细胞则强化IL-10产生和AP-1激活。

　　联合分析显示口服抗原诱导的Treg细胞群体在免疫调节中的互补关联网络，强调了多种Treg细胞亚群在维持免疫耐受和预防ADA形成中的协同作用。

　　04研究结论

　　口服抗原诱导Treg细胞亚群，在免疫耐受和预防ADA形成中发挥关键作用，为改良血友病治疗策略提供了科学依据，有望改善患者的治疗效果和生活质量。

　　05研究结果展开

　　图1.显示口服抗原可以有效诱导特定Treg细胞亚群

　　a.展示小鼠口服含hFVIII抗原片段生菜8周，接受rhFVIII注射4周。

　　b.显示接受hFVIII抗原灌胃的小鼠，Treg细胞亚群（FoxP3+LAP-、FoxP3+LAP+和FoxP3-LAP+）在脾脏CD4+T细胞中的变化，与对照组相比较，可以观察到实验组显著提高。

　　c.显示不同Treg细胞亚群产生IL-10的能力，对比发现FoxP3-LAP+T细胞能力最强。

　　d.展示不同Treg细胞亚群与CD4+常规T细胞体外共培养时细胞增殖情况。

　　e.展示不同Treg细胞亚群与CD4+常规T细胞体外共培养时，T细胞表达FoxP3情况。

　　f.展示FoxP3-LAP+T细胞与CD4+常规T细胞体外共培养时，FoxP3-LAP+T细胞本身表达FoxP3的情况。

　　图2.展示FoxP3+LAP-和FoxP3-LAP+细胞群之间，mRNA测序发现的基因表达差异

　　b.展示FoxP3+LAP-和FoxP3-LAP+细胞群mRNA测序数据处理流程。

　　c.维恩图和主成分分析显示2个细胞群之间mRNA测序数据异同和方差分析。

　　d.火山图显示2个细胞群之间的差异表达基因（DEGs）。上调基因为红色，下调为蓝色。

　　e.通路富集显示排名前35条功能通路。

　　f.GO分析显示排名前26富集通路。

　　图3.FoxP3-LAP+和FoxP3+LAP-细胞群体mRNA测序数据挖掘所发现的功能性基因通路整体变化

　　其中包含TNF/TNFR超家族基因、细胞因子/受体基因、趋化因子/受体基因、髓系细胞标志基因、转录因子基因、Treg细胞标志基因和TCR信号通路基因。

　　图4.展示流式细胞仪分析Treg细胞不同亚群的表型特征

　　a.不同细胞亚群标记分子检测结果，包括CD69、CD44、CTLA-4、PD1、LAG3、ICOS、GARP、NRP1、IRF4以及BATF。

　　b.不同细胞亚群标记分子检测结果，包括CCR2、Ly6C2、CCR7和MHCII。

　　图5.显示应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术检测三种Treg细胞亚群

　　a.展示小鼠实验设计。

　　b.维恩图展示三种细胞亚群之间基因异同。

　　c.UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）分析显示三种细胞亚群的单细胞测序聚类结果。

　　图6.三种Treg细胞亚群单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析结果显示代表性基因和通路的差异

　　a.小提琴图显示多种功能基因在不同群体之间的比较，包含IL2信号通路、TGFβ信号通路、TCR信号通路、IL-10信号通路、MHCII和髓样细胞标志基因。

　　b.簇点图显示多种功能基因在不同群体之间的比较。

　　图7.显示三个细胞亚群单细胞测序数据的综合UMAP分析

　　a.UMAP图显示三个亚群可分为14个簇。

　　b.14个簇在三个亚群中的占比。

　　c.三个亚群中第7簇的前10个过表达基因展示。

　　d.三个亚群中第11簇的前10个过表达基因展示。

　　e.FoxP3-LAP+与FoxP3+LAP-亚群的差异基因分析。

　　f.FoxP3-LAP+与FoxP3+LAP+亚群的差异基因分析。

　　g.FoxP3+LAP+与FoxP3+LAP-亚群的差异基因分析。

　　06总结与启发

　　该篇文献发表于Frontiers in Immunology（IF>9），展示了如何基于临床实际问题而开展科学研究，即探讨以口服抗原的形式来增强血友病治疗效果的可能性，以及利用相应单细胞测序技术来解析其中的细胞与分子机制。

　　文献中实验设计包括了小鼠模型选择、如何开展口服给药、流式细胞分析、单细胞测序分析、功能实验验证，这些环节共同构成一个系统流程。有关数据分析方法更多的基于实际需求，如UMAP分析、细胞分簇、DEGs筛选、通路分析等，以求最大程度利用已有数据解读相关机制。

　　总之，该课题基于实际临床问题和相关免疫学常识，来提出一个可测试的科学问题。该研究的实际价值在于提供了一种可能的新策略，用于预防或减少血友病患者在接受凝血因子替代疗法时产生的抗药物抗体（ADA）。

　　参考文献

　　Biswas M,So K,Bertolini TB,et al.Distinct functions and transcriptional signatures in orally induced regulatory T cell populations.Front.Immunol.2023;14:1278184.doi:10.3389/fimmu.2023.1278184.