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　　肠型胃癌(GC)的早期病变主要包括慢性萎缩性胃炎(CAG)和肠化生(IM)。CAG或IM患者会增加肠型胃癌的风险，CAG患者每年发生肠型胃癌的风险估计为0.1%/年，IM患者每年发生肠型胃癌的风险估计为0.25%/年。

　　从癌前病变到恶性病变的过程中，细胞类型会发生明显改变。CAG患者的主要特征是壁细胞和产生胃蛋白酶原的主细胞丧失，而IM患者的主要特征是出现肠特异性细胞类型，比如杯状细胞和肠上皮细胞。因此，细胞特征对鉴别胃粘膜癌前病变和恶性病变至关重要。

　　01研究目的

　　利用单细胞转录组学技术，全面系统地揭示胃前病变和恶性病变黏膜中个体细胞的表达谱，以获得胃黏膜中细胞异质性。

　　02研究方法

　　选取3例正常对照(NAG)，3例慢性萎缩性胃炎(CAG)，6例肠上皮化生(IM)，1例早期胃癌(EGC)患者的活检标本进行单细胞转录组测序，构建了胃癌前和癌早期病变的单细胞转录组图谱。

　　03研究结论

　　构建了胃癌前病变和早期癌粘膜的单细胞转录组图谱。利用图谱，表征了每个病变中不同细胞类型的表达模式，并分析了它们在病变中的变化。并鉴定了一组早期肿瘤细胞特异性标记基因，为精确诊断EGC提供了分子基础。

　　图1.胃窦粘膜癌前病变和早期癌变的单细胞图谱

　　图A.单细胞测序流程图，共收集13例标本：3例正常对照(NAG)，3例慢性萎缩性胃炎(CAG)，6例肠上皮化生(IM)，1例早期胃癌(EGC)。并使用10x Chromium平台生成RNA-seq数据。去除低质量细胞后，保留32332个细胞用于后续分析，每个细胞检测1941个基因。

　　图B.为了根据基因表达模式去识别不同的细胞群，使用Seurat软件包移除多个样本之间的批次效应，并对细胞进行降维分析和无监督细胞聚类。使用t-SNE法获得从NAG、CAG和IM到EGC的级联反应分布图，最终鉴定了总共17个主要细胞簇，包括上皮细胞（EPCAM、KRT18和MUC1）和非上皮细胞（VIM和PTPRC），将其定义为人胃粘膜癌前病变和早期癌病变的单细胞转录组图谱。

　　图C.细胞类型标志物。按细胞分类展示基因相对表达水平。

　　图D.既往研究表明，细胞因子和NF-κB通路都与胃炎诱导的胃肿瘤发生有关，因此，绘制了这两个信号通路中的一些介质的细胞来源。

　　图E.幽门螺杆菌-感染的IM样品（IMW 1、IMS 1和IMS 2）和未感染的IM样品（IMW 2、IMS 3和IMS 4）表皮细胞和间质细胞的t-SNE图。

　　图F.在幽门螺杆菌感染下，包括REG3A、Lcn2、COX7B和UQCRB在内的一些基因在胃粘膜内所有类型的细胞中表达一致上调，例如，抗菌蛋白LTF和BPIFB1在幽门螺杆菌感染的活检组织中的细胞中特异性上调。

　　图2.胃炎向EGC级联过程中上皮细胞的单细胞转录组

　　图A.来自胃粘膜的24223个上皮细胞按阶段的t-SNE图和按细胞类型的t-SNE图。

　　图B.多种病变中上皮细胞类型的比例。高度分化的细胞类型，如PMC,其比例随疾病进展而下降，与此相反，MSC在IM病变中出现，在疾病进展中限制增加，在EGC病变中达到最高。

　　图C.小提琴图显示TFF 1、TFF 2和肠特异性TFF 3在不同上皮细胞类型中的表达分布。发现TFF1、TFF2和TFF3的表达模式在不同的上皮细胞类型之间有明显的差别。

　　图D.系统地分析了不同病变上皮细胞的基因表达谱。使用Wilcoxon秩和检验，鉴定了不同病理状态下，各不同细胞的基因表达差异。将相同病变中的多种细胞类型的差异表达基因合并为病变相关标记，并观察到在具有这些标记的不同病变处的粘膜细胞有明显区别。

　　图E.胃癌前病变和早期癌病变的单细胞转录组网络：图片上部分为单细胞网络，节点代表每个病变粘膜中的主要上皮细胞类型，网络中边缘的厚度表示任何一对细胞类型的质心之间的Pearson相关系数，图片中间部分为分子网络标记物，显示每种病变典型细胞类型的假定网络标记物，其中带蓝色圈的结节代表胃炎或胃癌的高危基因。图片下方表示每种病变所涉及的整体分子特征的动态变化。

　　图3.不同病变胃粘膜分泌细胞系的scRNA谱

　　图A-C.t-SNE图显示了胃粘液分泌细胞谱系的分布（A），分别由标记基因MUC5AC（B）和MUC6（C）的表达标记。

　　图D.热图显示差异表达的功能基因，区分GMC细胞群和PMC细胞群。PMC主要表达与肌动蛋白细胞骨架和细菌侵袭有关的基因，而GMCs主要表达免疫反应和转化生长因子b(TGF-b)信号通路。

　　图E.分别来自CAG、IM和EGC病变中的样品的PMC的上调基因的最富集的途径。对于PMC，发现不同阶段的PMC的分子标志物富集在不同的通路中，包括CAG病变中矿物质吸收的上调，IM病变中的代谢，以及EGC病变中的氧化磷酸化。

　　图F.t-SNE图显示不同病变中的GMC。使用PCA分析发现这些表达MUC6的腺细胞可以被清楚地分为两个亚群。簇1富集了免疫和抗菌相关基因，这与正常胃窦腺细胞的分子特征一致，簇2富集了肠道干细胞或发育相关基因，包括OLFM4、PHLDA1和LEFTY1。

　　图G.火山图显示在两个杯状细胞亚群间差异表达的基因的倍数变化和调整的p值。表达OLFM4的GMC在CAG病变中很少检测到(0.4%)，而在野生IM病变中，表达OLFM4的GMC数量显著增加(8%)，在重度IM病变中达到高峰(26%)。在EGC损伤中，GMCs消失，表达OLFM4的细胞比例达到峰值，这两点与先前研究结果一致。

　　图H-I.IM活检标本，MUC6和LEFTY1（H）以及MUC6和OLFM4（I）双IF染色图像。

　　图J.显示在不同病变中单独或组合表达的细胞所占的相对百分比。

　　图4.不同病变肠内分泌细胞系的scRNA图谱

　　图A.t-SNE图显示肠内分泌细胞谱系的分布。

　　图B.肠内分泌细胞群被重新聚类成八个亚簇。

　　图C.每个样本中肠和胃内分泌细胞典型标志物的平均表达分布。胃内分泌细胞标志物以蓝色显示，而肠内分泌细胞标志物以红色显示。

　　图D.每个簇中表达典型标志物的细胞和不同病变处的细胞的分数。y轴表示表达典型标志物的细胞的比例，而x轴表示鉴定的八个簇。簇C8代表EGC病变中独特的内分泌细胞。

　　图E.t-SNE图显示OR51E1是EGC病变的内分泌细胞中上调最显著的标志物。红圈内的细胞是EGC病变中的内分泌细胞。

　　图F.来自患者P8的EGC活检中OR51 E1和CHGA的双重IF染色图像。

　　图5.HES6标记早期杯状细胞

　　图A.显示图谱中杯状细胞簇的分布的t-SNE图和放大的t-SNE图，显示五个亚簇的杯状细胞群体被重新聚类。

　　图B-C.显示两种杯状亚型和相对应的五种最富集途径的主要特征热图。通过将这些杯状细胞重新聚集成5个亚群，并分析它们的标记基因的共表达，总共观察到有两种主要模式：P1表现为参与代谢相关的途径，P2表现位参与细胞增殖相关的途径。

　　图D.小提琴图指示HES6在多种细胞类型中的表达谱。从P2中鉴定了新的marker，包括Hes家族的BHLH转录因子6(HES6)，HES6仅在不同上皮细胞中的杯状细胞中表达。

　　图E.显示杯状细胞簇中表达MUC2、HES6以及MUC2和HES6组合的细胞的百分比的条形图。

　　图F.小提琴图显示MUC2和HES6在杯状子簇中的表达分布。群集0用红色矩形突出显示。

　　图G.对切除的正常结肠样本中的HES6进行了IF染色图像，三角形表示结肠腺中的HES6表达细胞。

　　图H-I.活检中HES6和MUC2以及HES6和KI 67的双IF染色图像。

　　图6.EGC细胞的scRNA图谱

　　图A.t-SNE图显示图谱中癌细胞簇的分布。

　　图B.不同上皮细胞类型中的标志物CEACAM 6、细胞周期相关基因CCND 2和凋亡相关基因BAX的表达分布的箱形图，胃肠道肿瘤标记物基因CEACAM6、BAX和CCND2在癌细胞群中的特异性上调。

　　图C.癌症基因组图谱（TCGA）中GC数据集中推测的癌细胞相关的前六个上调基因差异表达的箱形图。发现识别到的新的markers在胃癌样本中显著高表达。

　　图D.数据集中不同上皮细胞类型之间的相似性网络。网络中边缘的厚度表示为任何一对细胞类型的质心之间的Pearson相关系数。

　　图E.癌症细胞质心与化生干样细胞（左）和肠细胞（右）之间的相关性。癌细胞簇与MSC簇和肠细胞簇具有强相关性。

　　图F.小提琴图显示先前报道的EGC相关标志物（FABP1、CDH17]和GRN）在癌细胞、肠细胞、胃粘液细胞和干细胞样细胞中的表达分布。

　　图G.EGC细胞的特征。单细胞图谱的基础上，通过选择那些在癌细胞中显著上调但在其他细胞类型中表达最低的基因来定义一组可信的EGC相关标记基因，总共由6个基因组成。

　　图H.来自IM、EGC和晚期胃癌（AGC）活检的切片中EGC标记KLK10中的代表性基因的IF染色。验证了这6个基因中最上调的基因KLK10的表达，发现KLK10在IM样本中呈阴性表达，在EGC样本中呈中度阳性表达，在AGC样本中呈强阳性表达。

　　04总结与启发

　　（1）研究人员利用单细胞转录组学技术来揭示胃前病变和恶性病变黏膜中单细胞的表达谱，以获得胃黏膜中细胞异质性。

　　（2）研究团队构建了癌前病变与EGC胃窦粘膜单细胞图谱；其次构建了胃炎向EGC级联过程中上皮细胞的单细胞网络图谱；之后构建了不同病变程度的胃粘膜分泌细胞系表达谱，以及不同病变程度的间肠内分泌细胞系的表达谱。

　　（3）鉴定出杯状细胞中的早期标记物HES6，有助于早期病理学鉴定；构建了EGC单细胞转录图谱，并识别了EGC细胞特异标志物，为精确诊断EGC提供了分子基础。

　　（4）提出了关于胃粘膜癌前病变过程中细胞异质性的新型见解，提供了有助于癌症预防筛查的标志物，促进了对胃癌发病机制的理解。

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　　参考文献

　　Zhang P,Yang M,Zhang Y,et al.Dissecting the Single-Cell Transcriptome Network Underlying Gastric Premalignant Lesions and Early Gastric Cancer.Cell Rep.2020;30(12):4317.doi:10.1016/j.celrep.2020.03.020