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　　生物药物是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。

　　在本质上区别于小分子的传统化学药物。生物药一般是复杂混合物或生物大分子，包括四大类：血液制品、疫苗、重组蛋白、单克隆抗体。

　　目前全球生物医药市场蓬勃发展，伴随生物技术的快速发展，生物药的品种与治疗范围不断优化，安全、有效、用途广等优势特征凸显，市场规模及份额快速扩大，抗体药更是成为全球最畅销且增速最快的药物。

　　01背景介绍

　　组成生物药物的蛋白质是维系生命活动的生物大分子，由一条或多条肽链组成，每条肽链都由一定数量的氨基酸按一定顺序通过肽键连接而成。

　　蛋白质的氨基酸序列组成蛋白质的一级结构，蛋白质测序是确定蛋白质氨基酸序列的过程。

　　通过蛋白质测序可以获得非常有用的信息，包括：识别蛋白质；提供有关翻译后修饰（PTMs）的信息，PTMs对蛋白质的结构和功能很重要；抗体药物研发改进等，因此蛋白质测序是生物医学领域的重要技术。

　　目前市场中的蛋白质测序方法主要分为三类：Edman降解测序、基于PCR扩增的蛋白质测序、基于质谱的蛋白质测序。

　　（1）Edman降解测序：是较早发展的蛋白质测序技术，利用化学方法从蛋白质的N端将氨基酸依次降解，再使用高效液相色谱对氨基酸进行鉴定。但该方法有一定局限性：只能测定N端的前20-25个氨基酸序列，不能用于N端封闭和修饰蛋白的测定。

　　（2）基于PCR扩增的蛋白质测序：是利用细胞中表达的DNA或者RNA进行基因测序，然后再按照氨基酸密码子表转换为蛋白质的氨基酸序列，这种方法本质上不能完全反映蛋白层面信息，无法鉴定翻译后修饰等重要信息。

　　（3）基于质谱的蛋白质测序：具有更高的灵敏度与特异性，通过其极强的定性能力，自下而上地对蛋白质酶解成的肽段进行分析，可以识别末端封闭，提供有关翻译后修饰的信息，产生的错误配对也要少得多。过去，认为对于质量数相近/相同的氨基酸，如赖氨酸vs.谷氨酰胺、亮氨酸vs.异亮氨酸无法用质谱区分；随着高分辨质谱的普及，以及ETD、EAD等碎裂技术的进步，这些问题都已被克服。

　　02技术定义

　　蛋白质从头测序技术（De Novo Sequencing）是利用串联质谱（MS/MS）获取离子，根据两个片段离子之间的质量差来计算肽链上氨基酸残基的质量，从而得到蛋白的氨基酸序列的分析过程。

　　该技术最大的优点在于不需要依赖任何数据库，就可对已知蛋白或未知蛋白进行序列分析。

　　03实验流程

　　De Novo Sequencing流程图

　　样品进行多酶解实验，将酶解后的肽段进行质谱检测，数据采集后的质谱图用de novo算法进行解析并获得对应的肽段序列，经过肽段间的比对拼接，从蛋白N端到C端拼装出来，得到蛋白的氨基酸序列。

　　目前可通过液相色谱与Obitrap Fusion高分辨质谱仪联用，建立蛋白从头测序（De Novo Sequencing）平台，保证了低丰度肽段碎裂片段鉴定的灵敏度，同时在肽段碎裂过程中采取HCD与ETD结合的碎裂模式，对亮氨酸/异亮氨酸这对同分异构体进行区分。

　　04数据解析

　　（1）肽段覆盖率

　　基于特异性和非特异性蛋白酶（Trypsin、Chymotrypsin、Glu-C、Lys-C、Pepsin、Elastase等）分别对蛋白样品进行酶切，使蛋白覆盖率达到100%和产生丰富的、重叠度高的肽段类型，最终得到测序所需的高质量数据。

　　（2）肽段拼接

　　采用HCD会产生一系列b/y离子，根据这些离子信息来推导肽段的序列。但是由于多种酶切会产生很多重复肽段，所以要对肽段进行一系列筛选。

　　首先要选择高峰度的肽段，其实是判断肽段二级离子的碎裂。但是当碎片离子缺失时，数据库搜索可能仍然成功。故为了提高从头测序准确性，采用的方法可能结合不同离子片段化技术产生多个谱图。

　　肽段SNNYATHYAESVK二级质谱图

　　（3）亮氨酸与异亮氨酸区分

　　在过去Leu和Ile通常被认为无法被MS区分，因为它们的分子质量完全相同。在可变结构域中定位不正确的Leu/Ile残基，特别是在抗体的CDR（互补性决定区）中，可能导致抗原结合亲和力和抗体特异性的实质性丧失。

　　亮氨酸和异亮氨酸在ETD碎裂条件下可以得到c/z离子，再辅助HCD碎裂，在z离子基础上脱掉一部分基团，形成w离子。亮氨酸脱掉丙基，形成43Da的丢失；异亮氨酸脱掉乙基，形成29Da的丢失。

　　单抗肽段DISLSDYK的ETD-HCD二级质谱图

　　05数据验证

　　与数据库搜索方法相比，当今从头测序软件的主要局限性是缺乏自动统计验证。如果没有这种自动验证方法，仍然需要手动检查肽谱匹配，以决定要认真对待哪些从头测序结果。

　　（1）分子量验证

　　通过蛋白质分子量（完整，还原，脱糖，脱糖还原）可以获得蛋白质的基本修饰信息（氧化、脱酰胺、N端环化、C末端K缺失、糖基化修饰），从而验证denovo得到的蛋白序列。

单抗完整分子量质谱图

　　（2）蛋白序列验证

　　denovo测定得到的序列建立新的数据库，对采集到的质谱数据再次进行覆盖率分析，得到几乎完全匹配的结果。

　　蛋白某一测序肽段序列覆盖率图

　　06总结与启发

　　（1）蛋白质测序技术可以检测疾病的生物标志物，可以提供全新的方式研究癌症等问题。

　　（2）在癌症、阿尔茨海默症、心力衰竭和糖尿病等许多疾病中，细胞产生的蛋白质等物质可以充当类似于指纹的独特的生物标志物，更好地检测这些生物标志物能够帮助研究人员了解疾病成因，也能为患者提供更早、更准确的诊断。

　　（3）华测多组学研究中心拥有蛋白质组学科研服务经验，其De Novo测序是基于质谱的蛋白质组学的关键技术之一，特别是对于新型蛋白质，其基因组信息通常有限或不可用。因此，未知蛋白质序列的完整从头测序具有非常重要的意义。

　　（4）采用抗体从头(De Novo)测序技术，可以辅助客户开展抗体药物研发相关科研项目，也能够大幅度缩短抗体药物研发周期及生产过程的质控，助力项目的实施与落地。

　　参考文献

　　1.Ma,B.,and Johnson,R.De novo sequencing and homology searching.Mol.Cell.Proteomics.11(2):O111.014902(2012).

　　2.Tran NH,Xin L,Shan B,Li M.Complete De Novo Assembly of Monoclonal Antibody Sequences.Sci Rep.2016

　　3.Yongsheng Xiao,and Dingyi Wen.Distinguishing between Leucine and Isoleucine by Integrated LC-MS Analysis using an Orbitrap Fusion Mass Spectrometer.Anal.Chem.2016