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　　传统医学观点认为“诸病皆生于气”，相应的经典药方“四逆散”，由柴胡、枳实、白芍、炙甘草四味药组成，则具有治疗多种“气机紊乱”之病的功能，可用于缓解患者的慢性心理压力。我国中医药领域研究学者，创新性的将四逆散关联到临床乳腺癌的发生发展，通过代谢组学手段，发现四逆散中的柚皮苷成分可以促进雌二醇代谢，从而为治疗雌激素受体阳性乳腺癌患者提供了一个新的思路和潜在候选分子，有力佐证了传统中药的临床应用价值。

　　四逆散(SNS)是一种经典中药配方，在我国常用于心理障碍患者，而长期心理压力是公认的乳腺癌致病因素之一，因此四逆散治疗乳腺癌的实验和机制分析极具意义。

　　01 研究目的

　　在慢性心理压力诱发乳腺癌发生过程中，探讨SNS通过何种活性成分，以何种机制调节雌激素代谢。

　　02 研究方法

　　采用小鼠乳腺癌异种移植模型，来检测SNS对乳腺癌生长转移的影响；通过代谢组学分析，来揭示SNS对代谢变化的影响；联合应用多种分子生物学实验和体内实验，进行目标化合物的功能实验。

　　03 研究结果

　　对于慢性心理压力诱导下的小鼠，SNS明显抑制了乳腺癌的生长和转移。在慢性心理压力环境中，胆酸水平提高，激活FXR受体表达，抑制HNF4α介导的EST在肝细胞中的转录，最终导致雌二醇升高。而SNS中的柚皮苷可以调节FXR/EST信号，加强肝细胞中的EST活性，来促进雌二醇代谢，以降低雌二醇水平，从而抑制了压力诱导的乳腺癌生长和转移。

　　04 研究结论

　　文章摘要示意图

　　本研究验证了压力诱导乳腺癌发展过程中FXR/EST信号通路，同时证明了SNS中柚皮苷成分能够促进雌二醇代谢，具有成为乳腺癌内分泌疗法药物的潜力。

　　图1. SNS抑制CUMS诱导的乳腺癌生长和转移

　　研究结果展开：图1 显示了SNS对CUMS小鼠乳腺癌体内生长和转移的抑制作用。

　　研究人员采用慢性不可预知性温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）引发抑郁的造模方法，建立了CUMS小鼠乳腺癌模型。图1A的流程图显示，雌性小鼠分为4组：对照组、CUMS组、CUMS+SNS低剂量组、CUMS+SNS高剂量组，经过1周的慢性心理压力刺激后，移植乳腺癌细胞，同时开始给予SNS治疗，期间监测肿瘤体积和体重变化，在3周后开始进行行为评估实验，包括：开放场地试验（OFT）、悬尾试验（TST）和蔗糖偏好试验（SPT），七周后收获样本，检测肿瘤大小、转移情况、E2和胆汁酸水平。

　　图1B显示CUMS组小鼠显示出明显抑郁状态，而SNS给药可以明显改善小鼠行为；图1C表明CUMS明显加快了肿瘤的生长速度，而高剂量的SNS给药可以明显抑制CUMS诱导的肿瘤生长；而整个治疗期间，各组小鼠体重变化相近（图1D），表明SNS的肿瘤抑制作用对于缓解CUMS刺激特别有效。

　　图1E和F检测了肿瘤转移情况，E中的肺部观察及HE结果显示，CUMS促进乳腺癌转移，而SNS治疗阻断了这种转移，HE染色结果表明，CUMS+SNS高剂量组中，转移病灶数量急剧减少。F显示了肿瘤转移的两种标记物：N-cadherin和vimentin，在高剂量SNS组表达降低。免疫组化检测显示类似结果，SNS明显抑制CUMS介导的肿瘤组织中Ki67的上调（图1G），表明细胞增殖得到了抑制。所有这些结果表明，SNS可以抑制CUMS诱发的乳腺癌生长和肺转移。

　　图2. SNS促进雌二醇代谢为雌二醇-3-O-硫酸盐

        图2 显示SNS对雌二醇代谢起到促进作用。

　　研究者认为雌二醇对于雌激素受体阳性（ER+）的乳腺癌生长转移具有重要作用，因此分别检测了肝脏、血清和肿瘤中的雌二醇及其代谢物雌二醇-3-O-硫酸盐的水平，图2A为LC-MS分析的雌二醇和雌二醇-3-O-硫酸盐的总离子流色谱图（TIC），表明实验平台适合于样品分析。

　　图2B统计结果显示，CUMS组雌二醇水平显著增加，同时雌二醇-3-O-硫酸盐减少；而SNS治疗组则可逆转这一现象。

　　图2C统计结果还显示了2-、4-和16-羟化途径的雌二醇代谢物变化情况，在CUMS组，2-羟基雌酮、2-甲氧基雌二醇和4-甲氧基雌二醇水平降低，而4-羟基雌酮和16α-羟基雌酮则升高，经过SNS治疗后，这些因子水平的变化发生逆转。

　　图2D分析描述了雌二醇在肝脏中的代谢情况，图中显示雌二醇代谢的关键步骤是其硫酸化，而雌激素硫酸转移酶（EST）起到了关键作用，表明SNS可能激活EST，促进雌二醇的硫酸化。

　　图3. 代谢组学研究发现SNS主要影响胆酸合成

　　图3 代谢组学研究揭示SNS影响胆酸水平。

　　研究者成功鉴定肝脏中的2322种代谢物，聚类分析表明各组间有清晰的分离，SNS处理后，明显改变了CUMS引起的代谢谱（图3A）。

　　图3B以热图显示代谢物的整体差异，图3C则进一步给出了78种明显差异的代谢物，图3D中的KEGG分析则表明主要通路富集在胆汁酸生物合成途径。因此，图3E重点比较分析了胆汁酸代谢途径的代谢物，结果显示SNS可以逆转CUMS引起的胆汁酸升高。基于这些发现，研究者在图3F中总结了胆汁酸的代谢途径，胆汁酸合成被确定为受SNS影响的主要通路。

　　图4. SNS通过调节FXR\EST信号以降低雌二醇

　　图4 显示SNS抑制FXR活性，促进EST介导的雌二醇代谢。

　　图4A以Western Blotting实验检测出SNS组降低FXR表达，升高EST水平；图4B则以免疫染色实验重复验证了这一发现。为进一步模拟SNS对雌二醇和胆汁酸的作用，研究者以肝脏LO2细胞系进行了药物功能实验，结果显示SNS在40μg/ml条件下明显促进了雌二醇代谢为雌二醇-3-O-硫酸盐（图4C），而降低了胆汁酸水平（图4D）。

　　图4E重复应用免疫荧光染色实验，验证了SNS处理组与对照组之间，LO2细胞中FXR和EST蛋白的水平存在差异。图4F则显示了胆酸诱导雌二醇实验的结果，结果显示SNS处理可以抑制胆酸诱导的雌二醇水平增加。这些结果与体内实验结果抑制，表明CUMS环境下，胆酸升高是导致雌二醇升高的重要原因，而SNS则可以促进雌二醇代谢，降低雌二醇水平。

　　图5. SNS影响HNF4α介导的EST转录

　　图5 SNS通过胆酸调节EST表达的机制研究。

　　图5A和B分别显示了免疫印迹和免疫荧光实验结果，表明SNS处理48小时候，FXR和EST的蛋白水平变化最为明显。图5C通过PCR实验检测了EST转录因子HNF4α变化，发现了HNF4α在SNS给药48小时后明显升高；图5D和E则用免疫印迹和免疫荧光实验，分别在蛋白水平上验证了HNF4α的这一变化。

　　根据这一线索，图5F开展了FXR过表达实验，结果显示FXR过表达抑制了HNF4α和EST，而SNS的处理则逆转了这一过程；图5G和H则进一步应用免疫印迹和免疫荧光实验进行验证，证实FXR过表达可以抑制HNF4α的核转运，而SNS治疗则重新恢复了HNF4α的核转运。

　　图5I应用荧光素酶报告基因实验，结果显示SNS可以有效恢复EST转录活性。图5J采用染色质免疫共沉淀（ChIP）实验，检测HNF4α和EST启动子之间结合变化，进一步证明FXR过表达抑制HNF4α与EST启动子（S2位点）的结合，而SNS则恢复了这种结合。

　　图6. 共培养实验验证SNS抑制乳腺癌细胞转移

　　图6 检测SNS对于乳腺癌细胞转移侵袭能力的影响。

　　研究者建立了乳腺癌细胞和肝细胞的共培养系统，将小鼠乳腺癌细胞系E0771、小鼠正常肝脏细胞系AML12、人乳腺癌细胞系MCF7和人正常肝脏细胞系LO2共同培养。图6A依次显示了SNS处理24小时后，可以逆转皮质醇的影响，E0771和MCF-7细胞的迁移侵袭能力得到抑制；而图6B 检测了两个细胞系中迁移标记蛋白N-cadherin或vimentin的变化。图6C和D实验开展了类似平行实验，检测了SNS对于胆酸及雌二醇影响的逆转，结果同样证实了SNS对于乳腺癌细胞转移的抑制能力。

　　图7. 柚皮苷为SNS调节FXR/HNF4α/EST途径的活性化合物

       图7 鉴定出SNS中的柚皮苷成分为主要活性化合物。

　　研究者利用代谢组学，确认了SNS中的72个化合物，图7A显示了相对丰度最高的前10个化合物。图7B显示了荧光素酶报告基因实验结果，比较了这10个化合物对于EST激活的能力，发现柚皮苷活化能力最强。图7C则确定了柚皮苷在SNS中相对含量。

　　图7D、E、F则重复验证了柚皮苷对于EST、HNF4α、雌二醇、雌二醇-3-O-硫酸盐水平变化的影响，显示了柚皮苷与SNS影响效果一致。图7G、H则进行了大鼠实验，分别显示了柚皮苷的药代动力学数据，以及在心、肾、肝、肺、脾和乳腺中的分布，结果表明，柚皮苷主要富集在肝脏，在肝脏中进行雌二醇代谢。

　　图8. 柚皮苷在斑马鱼模型中展示抑制乳腺癌生长和转移的能力

　　图8 显示柚皮苷在斑马鱼乳腺癌模型中抑制肿瘤生长和转移。

　　研究者建立了斑马鱼乳腺癌异种移植模型，分别给与药物处理48小时，图8A中免疫荧光检测结果显示，柚皮苷处理可以恢复FXR和EST的表达水平。图8B显示柚皮苷可以促进雌二醇代谢成雌二醇-3-O-硫酸盐，降低胆酸水平。图8C验证了胆酸对雌二醇诱导的斑马鱼中乳腺癌生长和转移的影响，免疫荧光检测显示胆酸可以激活FXR表达，同时抑制EST水平。

　　图8D则显示柚皮苷可以逆转胆酸的诱导作用，免疫荧光检测显示，柚皮苷重新激活EST的表达，并抑制FXR的表达。图8E则显示联合应用这几种药物的验证结果，重复验证了柚皮苷可以重新激活EST的表达，并抑制由胆酸诱导的FXR表达。

　　图9. 柚皮苷抑制CUMS小鼠体内的乳腺癌生长和转移

       图9 显示柚皮苷在CUMS小鼠乳腺癌模型中抑制肿瘤生长和转移。

　　研究者进一步利用小鼠模型进行了柚皮苷功能的验证。图9A显示了类似图1A的实验设计，在图9B中描述了小鼠OFT、TST和SPT的行为分析，并在图9C和D中展示了不同组的乳腺癌生长曲线和体重变化。

　　图9E则展示了肿瘤肺部转移及HE染色结果。图9F验证了肿瘤转移标记蛋白N-cadherin和vimentin的变化,以及细胞增殖蛋白Ki67变化。图9G显示了柚皮苷对肝脏、血清和肿瘤中雌二醇和雌二醇-3-O-硫酸盐浓度的影响。 而图9H则对比了CUMS组与CUMS+柚皮苷组中FXR和EST免疫荧光分析的差异。所有这些结果表明，柚皮苷是SNS中主要有效成分。

　　05 总结与启发

　　本文研究了传统药方四宁散对于ER阳性乳腺癌的防治作用，研究者发现了四逆散可以缓解CUMS小鼠体内的乳腺癌进展，继而以代谢组学筛选入手，寻找到相关线索。

　　发现慢性心理压力会通过FXR/HNF4α/EST信号传导，导致胆酸和雌二醇的升高；而SNS则可以促进雌二醇代谢成雌二醇-3-O-硫酸盐，从而降低雌二醇水平。这为SNS的药物分子机理提供了佐证。研究者进而确定了柚皮苷为SNS中有效成分，是具有肝脏靶向能力的天然EST激动剂，为新型药物开发提供了一个重要候选化合物。

　　从这篇影响因子10分左右的文献，可以学到：

　　1. 代谢组学分析分析在研究中起到了重要推动作用，SNS作为相对复杂的药物，高通量的代谢组学平台提供了高效率的解决手段；　　　　　　

       2. 文章对于功能验证实验相对强调，除常规体外细胞功能验证外，以小鼠和斑马鱼两个动物模型进行了体外功能验证；

       3. 代谢组学分析手段在确定有效分子柚皮苷过程中起到了重要作用，充分表明代谢组生物信息分析的作用；

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　　参考文献
　　J Adv Res. 2023 May;47:189-207. Naringenin in Si-Ni-San formula inhibits chronic psychological stress-induced breast cancer growth and metastasis by modulating estrogen metabolism through FXR/EST pathway.