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　　真核生物中，约有1/3的蛋白质发生磷酸化修饰，磷酸化修饰是一种可逆的蛋白质翻译后修饰，是通过特异性激酶的作用，将腺嘌呤核苷三磷酸的磷酸基团转移到底物特定氨基酸的羟基侧链上形成磷酸酯键的过程。

　　真核细胞的蛋白质磷酸化，包括丝氨酸/苏氨酸磷酸化以及酪氨酸磷酸化，它们又统称为O-磷酸化。众多种类的激酶和磷酸酶，使细胞迅速地增加或减少磷酸化修饰，实现复杂而精确地调控。

　　磷酸化蛋白质组学研究已应用于多种临床问题，推动了人们对疾病发病机制的认知，并提供了一系列临床疾病治疗靶点和治疗方案，在疾病机理研究、药物开发和临床诊断中具有重要意义。

　　磷酸化蛋白质组学研究方法

　　图1. 磷酸化蛋白质组学研究流程(石文昊 等. 2018)基于质谱的“自下而上”的蛋白质组研究方法是常见的解析磷酸化蛋白质组方法。
　　质谱法可以发现并测定蛋白的一级结构，并确定磷酸化修饰位点信息。该方法包括：样本制备-蛋白质提取与酶解；磷酸化肽段富集；组分预分离及液质联用检测和数据解析(图 1）。以下简要介绍磷酸化肽段富集及分离技术。

　　01 磷酸化肽段富集技术

　　A. 固相金属离子亲和色谱(immobilized metal affinity chromatograph，IMAC)图2.IMAC-Fe3+（左）和-Ti4+（右）富集原理示意图利用过渡态金属阳离子，如 Fe3+、Ga3+、Zr4+ 等，作为亲和试剂，与带负电荷的磷酸根离子螯合，通过螯合配体以非共价相互作用固定在支持基质 上（如磁珠或硅颗粒），在去除非磷酸化肽段的过程中富集保留磷酸化肽段．Fe3+/Ti4+-IMAC为常用的磷酸化肽段富集方法（图2），多用于富集多磷酸化肽段，特异性高。Nitrilotriacetic acid (NTA) 或 Iminodiacetic acid (IDA)是常用的固相基质。

　　B. 氧化物亲和色谱(metal oxide affinity hromatography，MOAC)利用氧化金属和磷酸根基团中的氧结合的特性进行磷酸化肽段的富集。这些金属氧化物大多数是两性的，在酸性条件下结合磷酸化肽段，碱性条件下释放磷酸化肽段。二氧化钛(TiO2)是最常用的 MOAC 试剂，此外还有 Fe3O4。

　　图3. SIMAC流程示意图（Tine E. Thingholm?, et al. 2008）C. SIMAC：IMAC 顺序洗脱 (sequential elution from IMAC)将IMAC 和 MOAC 结合，通过调整有机相比例和pH值来富集更多的单磷酸化肽段和多磷酸化肽段。这一方法通过梯度洗脱（如，单磷酸化肽在强酸性条件下洗脱(1%TFA, 20% acetonitrile, pH1.0)，多磷酸化肽在碱性条件洗脱 (氨水，pH11.3)，图3 ），降低了磷酸肽组分的复杂程度，有利于质谱检测。

　　02 磷酸化肽段的鉴定深度升级

　　磷酸化肽段的检测深度依赖于酶解效率和预分级技术。研究表明，相比传统的Trypsin酶解，利用 Lys C 和Trypsin共同酶解，可提高 40%的磷酸化检测位点(Glatter T et al. 2012)。

　　预分离也是提高鉴定深度的方法，常用的磷酸化肽段预分级技术，包括反向液相预分离(RPLC)、亲水相互作用色谱（HILIC）、强阳离子交换(SCX)和强阴离子交换(SAX)。

　　离子交换色谱（SCX/SAX）基于带有不同电荷的酶切肽段与阴/阳离子固定相间的相互作用。

　　SCX是带负电的层析基质，在富集磷酸化肽段时，强酸性条件下的洗脱顺序为：多磷酸化肽段＞单磷酸化肽段＞非磷酸化肽段；SAX是带正电的层析基质，富集磷酸化肽段时，在中性或碱性条件下的洗脱顺序为：非磷酸化肽段＞单磷酸化肽段＞多磷酸化肽段；HILIC是基于亲水性分离肽段，极性较强的肽段后被洗脱，磷酸化肽段在梯度末端被富集。

　　为了提高磷酸化肽段的鉴定深度，会联合使用富集与预分级技术，通过优化富集材料、样品预处理及洗脱条件（如调节pH值和离子强度）等，以快速高效地筛选出与疾病相关的磷酸化蛋白，为人们提供更好的医疗和健康服务。相关服务直达：多组学科研服务

　　参考文献
　　石文昊, 童梦莎, 李恺, 等. 基于质谱的磷酸化蛋白质组学: 富集, 检测, 鉴定和定量[J]. 生物化学与生物物理进展, 2018, 45(12): 1250-1258.
　　Glatter T, Ludwig C, Ahrn佴 E, et al. Large-scale quantitative assessment of different in-solution protein digestion protocols reveals superior cleavage efficiency of tandem Lys-C/trypsin proteolysis over trypsin digestion. Journal of Proteome Research, 2012, 11(11): 5145-5156.
　　Batth T S, Francavilla C, Olsen J V. Off-line high-pH reversedphase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research, 2014, 13(12): 6176-6186.
　　Thingholm T E, Jensen O N, Robinson P J, et al. SIMAC (sequential elution from IMAC),aphosphoproteomics strategy for the rapid separation of monophosphorylated from multiply phosphorylated peptides[J]. Molecular & cellular proteomics, 2008, 7(4): 661-671.